CN104781393A

CN104781393A - 用于生产诱导肝细胞的方法和组合物

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Publication number: CN104781393A
Application number: CN201380058024.6A
Authority: CN
Inventors: K·P·西莫诺夫; H·乌帕尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-07-15
Also published as: US20150376570A1; CA2883714A1; IL237433A0; BR112015005011A2; WO2014039768A1; RU2015107036A; HK1212384A1; EP2892999A1; JP2015527084A; AU2013312440A1; ZA201501435B; US20140087416A1; KR20150052228A; SG11201501681SA; MX2015002917A

Abstract

本发明涉及用于通过重编程非肝细胞的细胞生成诱导肝细胞的方法和组合物。

Description

用于生产诱导肝细胞的方法和组合物

相关申请

本申请要求于2013年3月12日提交的美国临时申请第61/777,973号和2012年9月7日提交的美国临时申请第61/698,359号的权益，其二者均整体地并入本文以作参考。

序列表

本申请含有以ASCII格式经由EFS-Web提交的序列表，其整体地并入本文以作参考。所述ASCII拷贝创建于2013年8月15日，命名为P4968R1-WO_SL.txt，大小为48,692字节。

发明领域

本发明涉及用于通过重编程非肝细胞而产生诱导肝细胞的方法和组合物。

发明背景

Takahashi和Yamanaka于2006年报道了将编码四种蛋白质因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)的基因导入到分化的小鼠成体成纤维细胞中诱导这些细胞成为多能干细胞(诱导多能干细胞)(参见Takahashi和Yamanaka(2006)Cell 126:663-676)。在这篇原始报道之后，还通过用编码类似的人类蛋白质因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的基因转化人类体细胞，或通过用编码人类OCT4和SOX2因子的基因加上编码两个其它人类因子(NANOG和LIN28)的基因转化人类体细胞，在人细胞中诱导多能干细胞(分别参见Takahashi等人,(2007)Cell 131:861-872和Yu等人,(2007)Science 318:1917-1920；参见Huangfu等人,(2008)Nature Biotechnology 26:1269-1275)。报道的这些方法使用反转录病毒或慢病毒使得编码重编程因子的基因整合到转化的细胞的基因组中。然而，产生的重编程细胞的基因组含有病毒DNA，其可能引起有害的遗传后果。许多后续研究通过使用非整合型腺病毒和慢病毒(Sommer 2009StemCells 27:543-549)；瞬时表达载体(Okita 2008Science 322；949-953)；和载体序列的靶向整合和切除(Kaji 2009Nature 458:771-775；Woltjen 2009Nature 458:766-770)，来解决这一问题。然而，这些途径仍然涉及病毒、基因整合或DNA质粒载体的使用，因此对于临床应用而言呈现出多种生物学和管理上的障碍。若干研究通过描述无病毒且无DNA的多能重编程方法已经解决了该问题。已将多能重编程因子作为重组蛋白质、合成mRNA和合成miRNA引入(参见，例如Zhou等人,(2009)Cell Stem Cell4:381-384；Warren等人,(2010)Cell Stem Cell 7:618-630；和Miyoshi等人,(2011)Cell Stem Cell 8:633-638)。

两则最近的报道描述了通过将编码定义的转录因子的多种基因的组合导入到小鼠成纤维细胞中使小鼠成纤维细胞直接转化成肝细胞样细胞，而不需首先经过多能的中间态(参见Huang等人,(2011)Nature 475:386-389；以及Sekiya和Suzuki(2011)Nature 475:390-393)。在这些报道中，Huang鉴定了Gata4、Hnf1α和Foxa3的组合(连同p19^Arf的失活)足以诱导鼠肝转化；Sekiya和Suzuki鉴定了诱导鼠肝转化的三种特定的双转录因子组合，包括Hnf4α加Foxa1、Foxa2或Foxa3。如在以上提到的非常早期的重编程研究中，Huang等人以及Sekiya和Suzuki都使用慢病毒或反转录病毒介导的转导以在小鼠成纤维细胞中表达转录因子。然而，尽管已经使用多种非整合型和非基于DNA的方法证实了重编程至多能性(如在以上引用的研究中所描述)，但从未描述过既不使用小鼠细胞也不使用人细胞、不使用重编程因子的整合型慢病毒或反转录病毒介导的递送的一种体细胞向另一类型的直接转化。

尽管成纤维细胞的直接转化已经在小鼠细胞包括神经元、造血细胞、心肌细胞和肝细胞中实现，但仅有少数成功地应用于人细胞(参见Vierbuchen等人,(2010)Nature 463:1035-1041；Szabo等人,(2010)Nature468:521-526；Ieda等人,(2010)142:375-386；Huang等人,(2011)Nature475:386-389；Sekiya&Suzuk(2011)Nature 475:390-393；Pang等人,(2011)Nature 476:220-223；以及Ieda等人,(2010)Cell 142:375-386)。尽管近来的报道描述了成功鉴定了对将小鼠成纤维细胞重编程为小鼠肝细胞样细胞必需且充分的因子和过程，该相同的方法学在应用于人细胞时不一定成功。科学文献已表明，改变小鼠细胞的分化状态所必需且充分的因子和过程可能不同于改变人细胞的分化状态所必需且充分的因子和过程(参见，例如Yi等人,(2012)Cell Research 22:616-619；Gonzalez等人,(2011)NatureReviews Genetics 12:231-242；Pang等人,(2011)Nature 476:220-223；Vierbuchen&Wernig(2011)Nature Biotechnology 29:892-907)。

从非肝细胞的细胞产生人类诱导肝细胞而没有任何基因组改变的风险作为通过细胞移植治疗疾病的途径提供巨大前景。从得自个体患者的人类非肝细胞的细胞产生的人类诱导肝细胞可以使不具有免疫排斥的患者特异性疗法的开发成为可能，由此消除免疫抑制程序的需求。另外，从疾病特异性的非肝细胞的细胞产生人类诱导肝细胞能够提供用于建模和研究特定疾病状态并开发可用于治疗这些疾病的治疗剂的工具。

因此，本领域对于鉴定将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞所必需且充分的关键转录因子存在需求。本发明通过提供可用于从人类非肝细胞的细胞产生人类诱导肝细胞的方法和组合物而满足该需求。

发明概述

本发明部分地提供用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞、诱导肝细胞群体的方法和组合物、包含诱导肝细胞的组合物以及其用途。在一些实施方案中，非肝细胞的细胞是非肝细胞的体细胞。在其它实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于通过重编程人类非肝细胞的细胞来产生人类诱导肝细胞。

本文提供的方法和组合物可用于高效率地将起始细胞或起始细胞群体(例如，非肝细胞的细胞或非肝细胞的细胞群体)重编程为诱导肝细胞或诱导肝细胞群体。在一些实施方案中，起始细胞或起始细胞群体是人类非肝细胞的细胞或人类非肝细胞的细胞群体(例如，人源的非肝细胞的细胞)，且产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞或人类诱导肝细胞群体。

本发明的发明人已经鉴定FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4(以及其多种组合)是能够将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的关键重编程因子。本发明的发明人还已鉴定CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A和HNF4A是能够将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的关键重编程因子。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，该方法包含，提供非肝细胞的细胞，将该非肝细胞与提高或诱导一种或多种重编程因子的表达或活性的活性剂接触，以及在适合于重编程非肝细胞的细胞的条件下培养该非肝细胞的细胞，由此从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述活性剂提高或诱导以下因子中的一种或多种的表达或活性：FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4。在其它实施方案中，所述活性剂是编码以下因子中的一种或多种的核酸：FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4。在其它实施方案中，所述活性剂是以下因子中的一种或多种：FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4。在另外的其它实施方式中，所述活性剂提高或诱导以下因子中的一种或多种的表达或活性：CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A和HNF4A。在另外的其它实施方式中，所述活性剂是编码以下因子中的一种或多种的核酸：CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A和HNF4A。在另外的实施方案中，所述活性剂是以下因子中的一种或多种：CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A和HNF4A。在一些实施方案中，所述核酸是能够表达重编程因子的核酸。在一些实施方案中，所述核酸是RNA或mRNA。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码一种或多种重编程因子的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述核酸制剂是编码一种或多种重编程分子的核酸的混合物(例如，包含不同核酸分子的混合物的核酸制剂)。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含能够表达一种或多种重编程因子的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述核酸制剂是编码一种或多种重编程分子并且能够表达所述一种或多种重编程因子的核酸的混合物(例如，包含不同核酸分子的混合物的核酸制剂)。

在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA3、HNF1A和HNF4A的核酸分子，编码FOXA1、FOXA2、HNF1A和HNF4A的核酸分子，或编码FOXA2、FOXA3、HNF1A和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA1、HNF1A和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA3、HNF1A和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA2、HNF1A和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA3和HNF1A的核酸分子，编码FOXA1、FOXA2和HNF1A的核酸分子，或编码FOXA2、FOXA3和HNF1A的核酸分子。在某些实施方案中，编码重编程因子的核酸分子是RNA分子或mRNA分子。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、含有SEQ ID NO:41的核酸序列和含有SEQ ID NO:43的核酸序列，以及在适合于重编程的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ IDNO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ IDNO:41的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ IDNO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ IDNO:41的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列,含有SEQ ID NO:35的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ IDNO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ IDNO:39的核酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、包含SEG ID NO:38的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且得到的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、包含SEG ID NO:38的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEG ID NO:38的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEG ID NO:36的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、包含SEGID NO:38的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和包含SEQID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码的氨基酸序列包含含有SEG ID NO:38的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码的氨基酸序列包含含有SEG ID NO:36的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEG ID NO:38的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码的氨基酸序列包含含有SEGID NO:34的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、和包含SEQID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码的氨基酸序列包含含有SEG ID NO:36的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入包含一种或多种重编程因子的蛋白质制剂，在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质制剂是一种或多种重编程因子蛋白质或多肽的混合物。在一些实施方案中，用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞(例如，用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞)的蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4。在一些实施方案中，用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞(例如，用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞)的蛋白质制剂包含CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA1、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA2、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA3、和HNF1A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、和HNF1A。在其它实施方案中，所述蛋白质制剂包含FOXA2、FOXA3、和HNF1A。

本发明还提供诱导肝细胞群，其中使用本文描述的任何方法和组合物获得所述诱导肝细胞。在一些实施方案中，本发明所提供的诱导肝细胞群是均质的诱导肝细胞群。在一些方面，本发明所提供的均质的诱导肝细胞群是其中显著部分的细胞群包含诱导肝细胞的细胞群，诸如，例如这样的细胞群，其中群中多于约50％、多于约55％、多于约60％、多于约65％、多于约70％、多于约75％、多于约80％、多于约85％、多于约90％、多于约91％、多于约92％、多于约93％、多于约94％、多于约95％、多于约96％、多于约97％、多于约98％、或多于约99％的细胞是通过本发明方法和组合物产生的诱导肝细胞。

在其它方面，本发明还提供可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供可用于将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的核酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中所述核酸制剂包含编码CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA1、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA1、FOXA3、和HNF1A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA1、FOXA2、和HNF1A的核酸分子。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含编码FOXA2、FOXA3、和HNF1A的核酸分子。在某些实施方案中，编码重编程因子的核酸分子是RNA分子或mRNA分子。

在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、SEQ ID NO:41的核酸序列、和含有SEQ ID NO:43的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ IDNO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ IDNO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ IDNO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ IDNO:41的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，包含核酸制剂的组合物包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

在本文所提供方法的多个方面，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所得到的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。在本文所提供方法的一些方面，所述非肝细胞的细胞不是干细胞。在本文所提供方法的其它方面，所述非肝细胞的细胞不是多能细胞。在本文所提供方法的再其它方面，所述非肝细胞的细胞是体细胞，包括人类体细胞。

在多个方面，通过本发明方法获得的诱导肝细胞表达肝细胞基因，包括白蛋白、甲胎蛋白、1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18和δ样蛋白1。

本发明还提供包含通过本发明方法产生的诱导肝细胞的细胞组合物。在一些实施方案中，本发明提供诱导肝细胞的多种组合物，例如实质上没有肝细胞以外的细胞的细胞培养物或细胞群。此外提供了组合物，例如经富集、分离或纯化肝细胞的细胞培养物或细胞群。

本发明所提供的诱导肝细胞组合物可包含诱导肝细胞的均质群体。在一些方面，本发明提供包含诱导肝细胞的组合物，其中所述组合物包含诱导肝细胞的均质群体。在一些实施方案中，本发明提供诱导肝细胞的组合物，其中在所述组合物内细胞的百分比包含约1％、约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的诱导肝细胞。在一些实施方案中，包含诱导肝细胞的组合物中的细胞百分比为100％。

本发明提供可用于多种研究和治疗应用的诱导肝细胞或诱导肝细胞群。在一些实施方案中，本发明的诱导肝细胞被用作多种人类疾病和病症的模型。在其它实施方案中，本发明的诱导肝细胞被用作肝炎和其它肝病研究的模型。本发明提供诱导肝细胞，其可用于治疗多种退行性肝病或肝功能的遗传性或获得性缺陷。例如，本发明提供对有需要的患者提供基于细胞的疗法的方法，通过对所述患者施用经本文所公开的方法获得的诱导肝细胞群体。在某些实施方案中，所述有需要的患者患有肝病或肝病症，例如肝纤维化、硬化、肝衰竭、肝炎、肝癌等。

本发明还提供使用经本文所述的方法获得的诱导肝细胞就毒性(例如肝脏毒性)对药物候选物进行筛选的方法。在一些实施方案中，本发明提供就毒性或肝脏毒性对药物候选物进行筛选的方法，其通过使诱导肝细胞群与药物候选物接触并就毒性或肝脏毒性监测诱导肝细胞，从而鉴定所述药物候选物是否是毒性的。

本发明还提供重编程细胞培养基，其中所述重编程细胞培养基包含DMEM/F12+Glutamax培养基，10％胎牛血清(FBS)，1％胰岛素-转铁蛋白-硒，1％MEM非必需氨基酸，5mM HEPES缓冲液，20ng/ml人类肝细胞生长因子(HGF)，20ng/ml表皮生长因子(EGF)，20ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)，200ng/mL B18R和0.1μM地塞米松。在本发明方法的多个方面，在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养非肝细胞的细胞，其中细胞培养基是上述的重编程培养基。

在其它方面，本发明提供鉴定促进非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的因子的方法。

附图简介

图1列出的数据显示在用多种量的编码GFP或核GFP的mRNA转染的人新生儿包皮成纤维细胞中绿色荧光蛋白(GFP)和核GFP(NLS GFP)的表达和细胞定位。

图2列出的数据显示，重编程因子表达在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的混合物每日转染持续9天的人新生儿包皮成纤维细胞中得以维持。

图3列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的蛋白质表达和核定位。

图4列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图5列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中FOXA2蛋白质表达和核定位与甲胎蛋白(AFP)表达和胞质定位相关联。

图6列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中白蛋白蛋白质表达和适当的胞质定位。

图7列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中α1-抗胰蛋白酶(A1AT)、细胞角蛋白18(CK18)和δ样蛋白1(DLK1)基因表达的诱导。

图8列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中的双成核(bi-nucleation)。

图9列出的数据显示用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中的脂微滴。

图10列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的混合物转染的人胎儿肺成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图11A和11B列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的多种混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图12A和12B列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A和HNF4A的mRNA的多种混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图13A和13B列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA3、HNF1A和HNF4A的mRNA的多种混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图14A和14B列出的数据显示在用编码HNF1A的mRNA和用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A或GATA4的mRNA转染的人新生儿包皮成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图15列出人FOXA1的核酸序列(SEQ ID NO:33)。

图16列出人FOXA1的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)。

图17列出人FOXA2的核酸序列(SEQ ID NO:35)。

图18列出人FOXA2的氨基酸序列(SEQ ID NO:36)。

图19列出人FOXA3的核酸序列(SEQ ID NO:37)。

图20列出人FOXA3的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)。

图21列出人HNF1A的核酸序列(SEQ ID NO:39)。

图22列出人HNF1A的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。

图23列出人HNF4A的核酸序列(SEQ ID NO:41)。

图24列出人HNF4A的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。

图25列出人GATA4的核酸序列(SEQ ID NO:43)。

图26列出人GATA4的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)。

图27列出的数据显示在用编码C/EBPα、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、GATA6、HHEX、HNF1A、HNF1B、HNF4A和HNF6A的mRNA的混合物转染的人胎儿肺成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图28列出的数据显示在用编码C/EBPα、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、GATA6、HHEX、HNF1A、HNF1B、HNF4A和HNF6A的mRNA的混合物(11TF)或用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物(6TF)转染的人胎儿肺成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)基因表达的诱导。

图29A和29B列出的数据显示与在原代肝细胞中所观察的相比较，在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物转染的人新生儿包皮成纤维细胞(图29A)和人胎儿肺成纤维细胞(图29B)中多种肝细胞基因的表达水平。

图30列出的数据显示在用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物转染的人成纤维细胞中多种细胞表面标志物的表达水平。

图31列出的数据显示在用编码C/EBPα、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、GATA6、HHEX、HNF1A、HNF1B、HNF4A和HNF6A的mRNA的混合物(11TF)或用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA的混合物(6TF)转染的人成纤维细胞中多种浓度的地塞米松对白蛋白基因表达的影响。

图32列出的数据显示编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的多种转录因子在人成纤维细胞中诱导编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的转录因子的表达的能力。

图33列出的数据显示与在人肝细胞中所观察的相比较，用编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的转录因子的多种组合转染的人成纤维细胞的基因簇分析。

图34A和34B列出的数据显示与在原代肝细胞中所观察的相比较，在分别用6TF mRNA混合物转染的人胎儿成纤维细胞和在人胚胎干细胞中33种肝细胞基因的基因表达水平。

图35A和35B列出的数据显示经RNA测序得到的全局基因转录组表达相似性和全局小RNA表达相似性的比较，其分别制图为用6TF mRNA混合物、11TF mRNA混合物和载体对照转染的人胎儿成纤维细胞的log2比率。

图36列出的数据显示在用6TF mRNA混合物转染的人胎儿肝细胞中高于载体处理的对照细胞的前25种上调基因的log2比率(红色，肝相关基因；蓝色，其它内胚层基因；绿色，组蛋白基因)。

图37列出的数据显示与在载体处理的对照细胞中所观察的相比较，在用6TF mRNA混合物转染的人胎儿成纤维细胞中组蛋白的上调，其制图为RPKM log2。

图38列出的数据显示在用6TF mRNA混合物转染的人胎儿成纤维细胞中较之对照上调或下调超过2倍的组织特异性基因的log2比率。

发明详述

本发明提供尤其是可用于非肝细胞的细胞到诱导肝细胞的高效重编程的方法和组合物、诱导肝细胞群、包含诱导肝细胞的组合物以及其用途。本文描述的方法和组合物可用于高效率地将起始细胞群(例如，非肝细胞的细胞群)重编程为诱导肝细胞群体。本发明还包含这样的组合物，其包含编码可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的重编程因子的核酸。本发明还包含这样的组合物，其包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的重编程因子多肽。在多个方面，非肝细胞的细胞来源于人，并且诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

应当理解，提及本文所述的诱导肝细胞群考虑并且包括分离的诱导肝细胞群。

一般方法

除非另外指明，本发明的实践将采用本领域技术人员知晓且可得的细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术记载于文献中，例如Molecular Cloning:A laboratory Manual,第三版(Sambrook等人,2001)Cold Spring HarborPress；Oligonucleotide Synthesis(P.Herdewijn,编辑,2004)；Animal CellCulture(R.I.Freshney,编辑,1987)；Methods in Enzymology(AcademicPress,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人,编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；以及Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

定义

术语“非肝细胞的细胞”涵盖非肝细胞来源的细胞或非肝细胞的分化状态或谱系的细胞。非肝细胞的细胞可包括体细胞。非肝细胞的细胞的非限制性实例包括成纤维细胞、骨髓细胞、脐血细胞、内皮细胞(例如人脐静脉内皮细胞)、角质形成细胞、系膜细胞、胚胎干细胞等。

术语“诱导肝细胞”涵盖通过实验操作从非肝细胞的细胞产生或获得的肝细胞(例如，肝细胞的细胞)。诱导肝细胞表达指示着肝细胞谱系细胞的标志物，诸如，例如白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶等。诱导肝细胞可以具有功能性肝细胞的特征，包括功能性未成熟肝细胞、肝细胞前体、或成熟肝细胞，例如双成核、中性脂滴、糖原贮积和例如白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、δ样蛋白1(DLK1)、CD133、N-钙黏着蛋白(NCAD)等的表达。

术语“重编程”是指细胞的分化状态改变成不同的分化状态的过程。重编程还指终末分化的细胞(例如，终末分化的体细胞)的分化状态改变成不同的分化状态的过程。

术语“体细胞”涵盖生物体内不能形成生物体内的所有类型细胞的任何细胞，即，非多能性的细胞。换言之，体细胞是已经充分分化的细胞，其不会自然产生机体的所有三个胚层(即，外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。

本文使用的术语“引入”是指将活性剂、蛋白质、多肽或核酸带入活细胞的过程，包括但不限于通过本文所述的引入方式。

本文使用的术语“接触”是指将活性剂、蛋白质、多肽或核酸与活细胞接触的过程，包括但不限于通过本文所述的接触方式。

本文使用的术语“重编程因子”是指这样的蛋白质、多肽、多核苷酸、核酸或其它生物分子，其在单独使用或与其他因子或条件组合使用时，导致其中引入或表达该重编程因子的细胞的分化状态改变。在本发明的一些实施方案中，重编程因子是由核酸(例如，mRNA)编码的蛋白质或多肽，对其而言，编码该重编程因子的核酸被引入细胞中，从而产生与未引入编码重编程因子的核酸的细胞相比表现出改变的分化状态的细胞。在某些情况下，重编程因子是转录因子。

提及“在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下”培养非肝细胞的细胞是指这样的生长条件，其会支持目标细胞(即诱导肝细胞)和起始细胞类型(例如，新生儿成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、角质形成细胞、间充质干细胞、造血干细胞等)的生长和健康。

术语“药物制剂”是指这样的制剂，其处于允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，并不含有对该制剂所施用的对象所不能接受的毒性的额外组分。

本文使用的“治疗”(以及其语法上的变形例如“治疗”或“治疗”)是指尝试改变所治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可以就预防而进行或在临床病理期间进行。合意的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。

本文使用的“有效量”是指有效达到任何本文所述方法的目的(例如，期望目的)的量。

除非另外指明，本文使用的单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数形式的提及。

本文中提及“约”某数值或参数是指该技术领域的技术人员容易知晓的对于各值的通常的误差范围。本文中提及“约”某数值或参数包括(并描述)涉及该数值或参数本身的方面。例如，提到“约X”的记载包括“X”的记载。

产生诱导肝细胞的方法

本发明提供高效地将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法和组合物、通过本发明方法产生的诱导肝细胞群、包含通过本发明方法产生的诱导肝细胞的组合物、以及其用途。本文描述的方法和组合物可用于高效率地将起始细胞或起始细胞群(例如，非肝细胞的细胞或非肝细胞的细胞群)重编程为诱导肝细胞或诱导肝细胞群。在一些实施方案中，该起始细胞或起始细胞群是人类非肝细胞的细胞或人类非肝细胞的细胞群(例如，人源的非肝细胞的细胞)，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞或人类诱导肝细胞群。

可使用多种类型的非肝细胞的细胞的起始细胞群来实践本发明的方法，包括，例如成纤维细胞、间充质细胞、角质形成细胞、造血细胞等。非肝细胞的细胞可以是成体或非成体来源，包括新生儿、胎儿和胚胎非肝细胞的细胞。可用于本发明方法的起始细胞还包括原代胚胎细胞、胎儿细胞、新生儿细胞、体细胞、血细胞(例如，造血细胞)、非成体细胞、以及衍生自成体组织、脐带组织、胎盘组织、骨髓和其它细胞来源的细胞。在某些实施方案中，非肝细胞的细胞的起始细胞或起始细胞群体来源于人(即，人类非肝细胞的细胞)，并且根据本发明方法由其产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

本发明的发明人已鉴定了足以将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的关键重编程因子。所鉴定的可用于将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的重编程因子包括叉头框蛋白A1(FOXA1)，亦称为肝细胞核因子3α(HNF3A)；叉头框蛋白A2(FOXA2)，亦称为肝细胞核因子3β(HNF3B)或转录因子3B(TCF3B)；叉头框蛋白A3(FOXA3)，亦称为肝细胞核因子3γ(HNF3G)或转录因子3G(TCF3G)；肝细胞核因子1同源框A(HNF1A)；肝细胞核因子4α(HNF4A)，亦称为核受体亚家族2，组A，成员1(NR2A1)；以及转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)。鉴定的其它可用于将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的重编程因子包括CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B和HNF6A。本发明公开了重编程因子的多种组合对于将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞而言是重要的。

在一些实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码一种或多种重编程因子的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述核酸制剂是编码一种或多种重编程分子的核酸的混合物(例如，包含核酸分子的混合物的核酸制剂)。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、含有SEQ ID NO:41的核酸序列、和含有SEQ ID NO:43的核酸序列，以及在适合于重编程的条件下培养非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列、包含SEG ID NO:38的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列、和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列、含有SEG ID NO:38的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列、含有SEG ID NO:38的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列、含有SEG ID NO:36的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列、含有SEG ID NO:38的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码的氨基酸序列包含含有SEG ID NO:38的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

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在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA3、和HNF1A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

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在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、和HNF1A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码FOXA2、FOXA3、和HNF1A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码多肽的核酸分子，其编码含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列、含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列、和含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入核酸制剂，其中所述核酸制剂包含编码CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A的核酸分子，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在特定的实施方案中，所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在其它实施方案中，本发明提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法(例如，将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法)，所述方法包含：提供非肝细胞的细胞，向所述非肝细胞的细胞中引入包含一种或多种重编程因子的蛋白质制剂，在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养所述非肝细胞的细胞，由此从所述非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质制剂是一种或多种重编程因子蛋白质或多肽的混合物。

在一些实施方案中，用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞(例如，用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞)的蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA1、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA2、HNF1A、和HNF4A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA3、和HNF1A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA1、FOXA2、和HNF1A。在其它实施方案中，该蛋白质制剂包含FOXA2、FOXA3、和HNF1A。在特定的实施方案中，该蛋白质制剂可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞，其中所述非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且所产生的诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在一些方面，可用于本文所述方法中的重编程因子可包含一种、两种、三种、四种、五种或六种重编程因子，其中重编程因子选自由FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4组成的组。在其它方面，重编程因子选自由CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A组成的组。

在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A；FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A；或FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA1、HNF1A、和HNF4A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA3、HNF1A、和HNF4A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA2、HNF1A、和HNF4A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA1、FOXA3、和HNF1A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA1、FOXA2、和HNF1A。在一些实施方案中，可用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的重编程因子包含FOXA2、FOXA3、和HNF1A。在多个实施方案中，非肝细胞的细胞是人类非肝细胞的细胞，并且诱导肝细胞是人类诱导肝细胞。

在某些实施方案中，编码用于本文所述方法中的重编程因子的核酸分子是mRNA分子。在一些实施方案中，编码重编程因子的mRNA是纯化的mRNA。在一些实施方案中，通过由编码重编程因子的模板DNA体外转录来产生mRNA。在其它实施方案中，编码用于本文所述方法中的重编程因子的核酸分子是DNA分子。在一些实施方案中，编码重编程因子的DNA是基因组DNA。在其它实施方案中，编码重编程因子的DNA是cDNA。在其它实施方案中，编码用于本文所述方法中的重编程因子的核酸包含在质粒、载体、病毒等中。

用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的本发明方法不限于体外方法或程序。本发明还提供从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的体内方法。这些体内方法包括(但不限于)使用基于反转录病毒的途径引入编码一种或多种重编程因子的核酸用于体内施用，以及用于体内递送编码一种或多种重编程因子的mRNA分子(例如，体外转录的mRNA分子)(参见，例如，Qian等人,(2012)Nature 485:593-598和Song等人,(2012)Nature485:599-604)。可以应用这些在体内从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法来治疗多种疾病和病症，例如，通过将内源成纤维细胞或星状细胞重编程成诱导肝细胞来治疗纤维化或肝硬化肝脏疾病。

在本发明方法的一些实施方案中，向非肝细胞的细胞中引入核酸或核酸制剂的步骤包括用转染剂(例如，TRANSIT mRNA转染试剂)将核酸递送到细胞中。然而，本发明并不受核酸或核酸制剂引入非肝细胞的细胞的途径的性质所限，并且本发明也不受所利用的转染方法的性质所限。本文考虑了能够将核酸分子体外或体内递送或引入到细胞中的任何已知的转染方法或未来鉴定的方法，包括将核酸递送到培养物中或维持生命的介质中的细胞的方法，无论这些细胞包含分离细胞或是包含真核组织或器官的细胞，或将核酸体内递送到生物体例如人的细胞中的方法。可用的转染试剂包括脂质(例如脂质体、微团等)、纳米颗粒或纳米管、阳离子化合物(例如聚乙烯亚胺或PEI)等。可以使用其它的转染方法，包括使用电流将核酸递送到细胞(例如，通过电穿孔)或使用弹射方法将核酸递送到细胞(例如，“基因枪”或弹射颗粒递送系统)。

本发明提供通过向非肝细胞的细胞中引入核酸制剂将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的方法，其中核酸制剂包含编码重编程因子的核酸分子。在本发明方法的某些方面，可以以多种间隔、频率和时间段将编码重编程因子的核酸分子引入到非肝细胞的细胞。例如，可以以至少每日一次、至少每隔一日一次、至少每第三天一次、至少每四天一次、至少每五天一次、至少每六天一次、至少每七天一次、至少每八天一次、至少每九天一次等的频率将核酸分子引入到非肝细胞的细胞中。将核酸分子引入非肝细胞的细胞中可以以任何这些频率并以足以产生诱导肝细胞的持续时间发生，例如持续1天、持续2天、持续3天、持续4天、持续5天、持续6天、持续7天、持续8天、持续9天等。本领域普通技术人员可以容易地确定将编码转录因子的核酸制剂引入非肝细胞的细胞从而有效产生诱导肝细胞的频率和持续时间。

本发明还显示在非肝细胞的细胞中重编程因子的表达与引入(例如转染)到非肝细胞的细胞中的mRNA的量相关联，表明可以以剂量依赖的方式调节单个mRNA所编码的重编程因子的表达程度。本领域普通技术人员可以容易地确定和调节编码用于重编程非肝细胞的细胞的一种或多种转录因子的核酸(例如，mRNA)的量从而有效地产生诱导肝细胞。将非肝细胞的细胞有效地重编程为诱导肝细胞所需的核酸的量可以基于细胞类型、细胞数量、细胞培养条件等而改变。从实验上确定引入到非肝细胞的细胞中以有效产生诱导肝细胞的核酸(例如，mRNA)的量在本领域人员的普通技术范围之内。本发明的方法不局限于使用任何特定量的核酸以引入非肝细胞的细胞中从而产生诱导肝细胞。

本发明的方法对于重编程细胞而言较之以前描述的方法提供多个优点。在本发明的某些方面，将mRNA引入非肝细胞以产生诱导肝细胞中较之将例如DNA、质粒、载体、病毒等引入非肝细胞的细胞中提供多个优点。本发明所提供方法的一个优点是，将核酸引入到非肝细胞的细胞中并不导致核酸并入到细胞的基因组中。本发明方法的另一优点是，核酸(例如mRNA)翻译在核酸引入细胞中之后很快发生；因此所编码产物的表达和出现迅速。本发明方法的另一优点是，可以通过向细胞递送较多或较少的核酸来调节从核酸(例如mRNA)表达的重编程因子蛋白质的量。本发明方法的又一优点是，核酸向细胞的重复递送不引发免疫反应。本发明方法的另一优点是，不要求引入到非肝细胞的细胞中的mRNA分子进入细胞核，提供了更快速且高效的重编程。

根据本发明的一个实施方案，向非肝细胞的细胞群中引入核酸分子在没有细胞基因修饰的情况下发生，例如，没有核酸并入到细胞的基因组中。在此语境中缺少或没有基因修饰将被理解为，意指不存在稳定引入到诱导肝细胞的基因组中但未见于起始非肝细胞的细胞中的异源核酸序列(例如，编码转录因子的那些核酸序列)。异源是指所讨论的核酸已经使用基因工程或操纵引入到细胞或其祖先中。异源核酸可通常不存在于该类型的细胞中或可以对于细胞的内源基因是额外的(例如，额外拷贝的重编程因子，其中该内源拷贝已经失活或沉默)，但在各情形中异源核酸通过人为干预引入。

本发明还提供使用调节一种或多种本文所鉴定的重编程因子的表达或活性的方法和/或活性剂从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法。对一种或多种重编程因子的表达或活性的调节可以是通过直接激活(例如直接激活一种或多种本文所鉴定的重编程因子的表达或活性)或通过间接激活(例如间接激活一种或多种本文所鉴定的重编程因子的表达或活性)进行，其中直接激活或间接激活从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。

本文使用的直接或间接激活可以这样发生，其中活性剂或活性剂的组合诱导、激活或提高本文所述重编程因子中的一种或多种的表达或活性(即，诱导、激活或提高FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4中的一种或多种的表达或活性)。这样的直接或间接激活可以通过使非肝细胞的细胞与一种或多种有效诱导、激活或提高FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4中的一种或多种的表达或活性的活性剂接触而进行。这样的活性剂可包括调节重编程因子的表达或活性的任何活性剂例如小分子、生长因子和其它活性剂。

最近的报道显示，小分子kenpaullone有效地将鼠成纤维细胞重编程为诱导多能细胞，基本上代替重编程因子Klf4(参见Lyssiotis等人,(2009)PNAS 106:8912-8917)。该报道表明，可以鉴定有效地将一种分化状态的细胞重编程为另一分化状态的非转录因子的活性剂。本发明提供鉴定一种或多种能够直接或间接使非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的活性剂的方法。对于这些方法中的每一者，将非肝细胞的细胞的起始细胞培养物或细胞群体与一种或多种候选活性剂接触，并就重编程为诱导肝细胞监测细胞或细胞群(例如，通过检测、测量或定量指示诱导肝细胞的基因或蛋白质表达、活性或表型变化)。确定一种或多种候选活性剂是否能影响非肝细胞的细胞向诱导肝细胞的直接或间接重编程(或分化)的其它方法此前已有记载(参见，例如，WO 2007/127454)。

肝细胞群

本发明还提供诱导肝细胞群，其中使用本文描述的任何方法和组合物获得所述诱导肝细胞。在某些实施方案中，本发明所提供的诱导肝细胞群是均质的诱导肝细胞群。在一些方面，本发明所提供的均质的诱导肝细胞群是其中显著部分的细胞群包含诱导肝细胞的细胞群。本文使用的显著部分是指这样的细胞群，其中群中多于约50％、多于约55％、多于约60％、多于约65％、多于约70％、多于约75％、多于约80％、多于约85％、多于约90％、多于约91％、多于约92％、多于约93％、多于约94％、多于约95％、多于约96％、多于约97％、多于约98％、或多于约99％的细胞是诱导肝细胞。

在一些情况下，令人合意的是从包含非肝细胞的细胞和诱导肝细胞的细胞群富集诱导肝细胞。可以通过领域内熟知的多种富集细胞的技术和方法从非肝细胞的细胞和诱导肝细胞的混合物中富集本发明的诱导肝细胞。例如，可以使用细胞分选方法例如荧光激活细胞分选(FACS)来有效富集诱导肝细胞。

任意一种或多种的肝细胞细胞标志物的存在可以用于自非肝细胞的细胞群中区分、鉴定和富集通过本发明方法获得的诱导肝细胞或诱导肝细胞群。可以使用领域内已知且可得的标准方法检测肝细胞细胞标志物，这些方法包括但不限于，免疫组化、流式细胞术、荧光成像、PCR、Western印迹、Northern印迹等。例如，多种肝细胞细胞标志物可以是在诱导肝细胞上表达但不在非肝细胞的细胞上表达的细胞表面标志物，或对于肝细胞系细胞特异性的细胞表面标志物。细胞表面肝细胞标志物包括，例如E-钙黏着蛋白、DLK1、CD133等。肝细胞细胞标志物是本领域技术人员已知的(参见，例如，http://www.stembook.org/node/512)。可以在细胞培养的不同时间点或在将重编程因子(或编码重编程因子的核酸)引入到非肝细胞的细胞中之后，例如在一轮或多轮转染之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久，测量肝细胞细胞标志物。

对于本发明的某些实施方案，可以将诱导肝细胞富集、分离或纯化以用于多种研究和治疗应用。例如，可以通过使包括本发明的诱导肝细胞的细胞群与试剂接触，并从试剂未结合的细胞中分离试剂结合的细胞，来富集、分离或纯化本发明的诱导肝细胞，所述试剂与在诱导肝细胞中或在其上表达但在非肝细胞的细胞中或在其上实质上不表达的标志物结合或者与之相互作用。在富集、分离或纯化诱导肝细胞的一些实施方案中，标志物可以是在诱导肝细胞中或在其上表达但在非肝细胞的细胞中或在其上实质上不表达的任何标志物。这些标志物包括但不限于，白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、DLK1、CD133、N-钙黏着蛋白(NCAD)等。

使用本文所述方法获得的任何诱导肝细胞群可以以诱导肝细胞的细胞库的形式低温保存。可以将这些细胞库解冻用于后续治疗或实验用途。使用本领域技术人员已知且可得的方法可以将本发明的诱导肝细胞的细胞库制备成低温存储物和将其低温存储。

核酸组合物

本发明还提供可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供可用于将人类非肝细胞的细胞重编程为人类诱导肝细胞的核酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子；或者，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子；或者其中该核酸制剂包含编码FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA3、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA2、HNF1A、和HNF4A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA3、和HNF1A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA1、FOXA2、和HNF1A的核酸分子。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含编码FOXA2、FOXA3、和HNF1A的核酸分子。在多个实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸分子是RNA分子、mRNA分子、DNA分子、cDNA分子等。在特定的实施方案中，编码以上鉴定的重编程因子的核酸分子是纯化的或实质上纯化的核酸分子。在其它特定实施方案中，该核酸分子包含修饰的核苷酸或修饰的核苷，例如使用修饰的核苷例如甲基-CTP和假-UTP转录的mRNA分子。用于制备修饰的RNA分子的方法以前已有记载(参见，例如，国际申请公开第WO 2011/071931号和第WO 2007/024708号，和美国申请公开第US 2009/0286852号，其内容整体地并入本文以作参考)。

在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、SEQ IDNO:41的核酸序列、和含有SEQ ID NO:43的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ IDNO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和含有SEQ ID NO:41的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包含可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸制剂的组合物，其中该核酸制剂包含这样的核酸分子，其包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。在多个实施方案中，可用于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的核酸是编码重编程因子的DNA分子或mRNA分子，优选是纯化的DNA分子或纯化的mRNA分子。

诱导肝细胞的表征和鉴定

可以根据多项标准对本发明的诱导肝细胞进行表征和鉴定。这些标准包括但不限于，对表达的肝细胞细胞标志物、酶活性、肝细胞功能的检测或定量、肝细胞形态特征的表征等。在一些方面，待重编程为诱导肝细胞的非肝细胞的细胞可以含有包含肝细胞特异性转录控制元件例如肝细胞特异性基因启动子的报告基因，其可以用于鉴定诱导肝细胞。

在某些方面，本发明的诱导肝细胞具有肝细胞特征性的形态特征，例如在来源于器官来源的原代肝细胞中所观察到的。本领域技术人员容易知晓肝细胞特征性的形态特征，并且可包括任何或所有以下特征：多边形细胞形状、双成核表型、用于分泌型蛋白质合成的糙面内质网的存在、相对丰富或广泛的液泡、脂滴、用于细胞内蛋白质分选的高尔基体-内质网溶酶体复合物的存在、过氧化物酶体和糖原储存颗粒的存在、相对丰富的线粒体以及形成紧密的细胞间连接导致胆汁微管空间产生的能力。单细胞中存在的这些形态特征中的一种或多种与作为肝细胞系之一的细胞相一致。本发明的诱导肝细胞可具有肝细胞特征性的这些形态特征中的任意一种或多种，并且因此可以根据这些形态特征中的任意一种或多种进行表征或鉴定。

在其它方面，本发明的诱导肝细胞可以根据肝细胞特征性的多种表型标志物的表达或诱导进行表征或鉴定。肝细胞特征性的并且可用于鉴定诱导肝细胞的表型标志物的非限制性实例包括，例如白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18和DLK1。肝细胞特征性的表型标志物的其它实例包括色氨酸2,3-加双氧酶(Tdo2)、转铁蛋白、E-钙黏着蛋白、紧密连接蛋白(Tjp1)、脱唾液酸糖蛋白受体、apoE、精氨酸酶1、apoAI、apoAII、apoB、apoCIII、apoCII、醛缩酶B、醇脱氢酶1、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、尿素产生、甘油三酯合成、细胞色素p450活性等。本发明的诱导肝细胞可以具有肝细胞特征性的这些表型标志物中的任意一种或多种，并且因此可基于这些表型标志物中的任意一种或多种的表达或活性进行表征或鉴定。

在一些实施方案中，通过检测标志物的存在或活性，或者在一些情况下检测标志物的不存在，来确定某些标志物的表达。可以通过检测细胞培养物或细胞群的细胞或多个细胞内的、其表面上的、或由其分泌的标志物的存在，来确定肝细胞特征性的标志物的表达。检测可以是定量的或定性的。可以通过任何合适的免疫学方法来确定蛋白质表达，例如，流式细胞术、免疫组化、Western印迹分析、酶联免疫测定(ELISA)等。

可以通过PCR(包括定量PCR、实时PCR等)、Northern印迹分析、原位杂交等来确定肝细胞标志物的基因表达。本领域技术人员熟知并且可得到执行这些技术的方法。也可以使用领域内已知的其它方法对肝细胞标志物基因表达进行定量。例如，可以通过使用对于目的标志物基因产物特异性的抗体来检测标志物基因产物的表达。可以使用核酸杂交或扩增技术来检测一种或多种肝细胞标志物的存在、不存在、和/或表达水平。核酸杂交技术包括，例如，Northern印迹、狭缝印迹(slot blot)、RNA酶保护、原位杂交等。核酸扩增技术包括PCR、实时PCR、定量PCR等。用于检测和定量特定核酸的技术对于本领域技术人员是熟知的，并且描述于例如Ausubel等(参见，例如国际申请公开第WO 2007/127454号)中。

在某些方面，确定肝细胞特征性的标志物基因的表达以及非肝细胞的细胞(例如，成纤维细胞、角质形成细胞等)特征性的标志物基因的显著表达的缺乏。

包含诱导肝细胞的组合物

本发明提供包含通过本发明方法产生的诱导肝细胞的细胞组合物。在一些实施方案中，本发明提供诱导肝细胞的多种组合物，例如实质上没有肝细胞以外的细胞的细胞培养物或细胞群。此外，提供对诱导肝细胞进行富集、分离或纯化的组合物，例如细胞培养物或细胞群。

本发明所提供的诱导肝细胞的组合物可包含均质的诱导肝细胞群。在一些方面，本发明提供包含诱导肝细胞的组合物，其中该组合物包含均质的诱导肝细胞群。在一些实施方案中，本发明提供诱导肝细胞的组合物，其中组合物内的细胞百分比包含约1％、约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％诱导肝细胞。在一些实施方案中，包含诱导肝细胞的组合物中细胞的百分比是100％诱导肝细胞。

使用诱导肝细胞的方法

本发明提供可用于多种研究和治疗应用的诱导肝细胞或诱导肝细胞群体。这些应用包括诱导肝细胞在体内的移植或植入；体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂、生长/调节因子、药物化合物等；解释多种肝脏疾病和肝脏感染的机制；产生生物学活性产物等。例如，本发明的诱导肝细胞可以用于细胞和组织分化的进一步研究。本文所述的诱导肝细胞还可以用于测试新药物和治疗候选物的毒性测定中。并且，本发明的诱导肝细胞可以用于再生医学和治疗用途。

本发明的诱导肝细胞可以用于筛选可能影响本文所提供的诱导肝细胞的多种特性的多种因素(例如溶剂、治疗剂、肽和多核苷酸)或环境条件(例如培养条件或操作)。

在一些方面，本发明的多种筛选应用涉及药物研究中对药物化合物或活性剂的测试(参见，例如，Castell等人,In Vitro Methods in PharmaceuticalResearch,Academic Press,1997；和美国专利第5,030,015号)。在某些方面，本发明的诱导肝细胞可用于标准药物筛选和毒性测试，如以前已对肝细胞细胞系或原代肝细胞所进行的。候选药物化合物或活性剂的活性评价一般涉及到将诱导肝细胞与候选化合物组合，确定归因于化合物或活性剂的细胞形态、标志物表型或代谢活性的任何变化(与未经处理的细胞或用惰性化合物或惰性剂处理的细胞相比)，然后将化合物或活性剂的效果与所观察的变化相关联。筛选可以因化合物或活性剂被设计为对肝细胞具有药理学作用、或因化合物或活性剂可被设计为具有其他作用(例如，被设计为对非肝细胞的细胞有作用)而进行，并因此可能具有非预期的肝细胞副作用。可以组合测试两种或更多种化合物或活性剂(例如，两种或更多种药物)(通过同时或顺序地与诱导肝细胞组合)，来检测可能的药物-药物相互作用效果。

在一些方面，本发明的诱导肝细胞可用于就潜在的细胞毒性或肝脏毒性筛选化合物(参见Castell等人,(1997)见上文)。可通过化合物对细胞生存力、存活、形态以及酶和其它因子渗漏到培养基中的效果、或通过确定化合物对肝细胞功能的效果(诸如，例如，对糖异生、尿素生成、血浆蛋白质合成等)来确定细胞毒性或肝脏毒性。

评价细胞毒性或肝脏毒性的其它方法包括确定化合物对白蛋白、胆固醇和脂蛋白合成和分泌；缀合胆汁酸和胆红素的转运；尿素生成；细胞色素p450水平和活性；谷胱甘肽水平；a-谷胱甘肽s-转移酶的释放；ATP、ADP和AMP代谢；细胞内K+和Ca2+浓度；核基质蛋白质或寡核小体(oligonucleosome)的释放；和凋亡诱导的作用。化合物对DNA合成或结构的作用可以通过测量DNA合成或修复来加以确定。

本发明的诱导肝细胞还可以用作药物测试和开发过程的工具。例如，可使用细胞来评定考虑开发的药物候选物(例如，治疗药物候选物)所引起的基因表达谱的变化。可以将潜在药物引起的基因表达谱变化与已知影响肝脏的对照药物引起的情形相比较。这样使人们可以就化合物和药物早期在药物开发过程中对肝脏的效果对其进行筛选而不使用动物，从而节省时间和金钱。在一些实施方案中，本发明的诱导肝细胞用于高通量的药物筛选，例如以美国专利第7,282,366号中记载的方式。

本发明的诱导肝细胞还可以用于评定多种目的化合物或组合物例如化学、药学、化妆、杀生物或生物学化合物，食品添加剂或组合物，或其它生物学活性剂的毒性。在这样的毒性测定中可优选使用诱导肝细胞，因为诱导肝细胞更接近生物体肝脏中存在的细胞类型。例如，如果特定的化合物或组合物表现出对细胞生存力或对细胞代谢或功能的一个或多个方面的不利作用，则其被认为是毒性的或可能是毒性的。可以使用领域内已知的技术来测量细胞在体外的生存力，包括比色测定例如MTT(或MTT衍生方法)测定或LDH泄露测定，或使用基于荧光的测定，例如Live/Dead测定、CyQuant细胞增殖测定或细胞凋亡测定。其它可用的测定包括测量细胞代谢、蛋白质表达和分泌、功能等的特定方面的那些，如本文所述。

在一些实施方案中，本发明的诱导肝细胞可用作多种人类疾病和病症的模型。在许多方面，本发明的诱导肝细胞提供基于细胞的人类疾病体外模型，并且可用于多种实验和研究目的。在此用途的某些方面，用于这些方法中的非肝细胞的细胞从患有疾病或病症的个体获得。例如，一些人类病症例如某些肝脏病症具有单成因或多成因基础，并且可以使用本文提供的方法将从患有该病症的个体获得的非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞。在此用途的其它方面，用于这些方法中的非肝细胞的细胞可以从多个个体获得，允许产生具有广泛遗传多样性的诱导肝细胞，从而允许针对得自大量各种各样的供体的细胞中的人类疾病进行建模。该用途提供优于现有人类疾病建模方法的优点，在现有方法中细胞来源具有有限的多样性(例如，原代肝细胞、细胞系、衍生自多能细胞的肝细胞)。

这样的治疗方法的优势是没有获得肝活检的要求。已经描述过使用衍生自患者并分化成疾病相关的细胞类型的诱导多能干细胞的用途，且本发明考虑本文所提供的诱导肝细胞用于这些疾病建模应用的用途(参见，例如，Grskovic等人,(2011)Nature Reviews Drug Discovery 10:915-929；Rashid等人,(2010)J Clinical Investigation 120:3127-3136)。

在其它实施方案中，本发明的诱导肝细胞可用作肝炎和其它肝脏疾病研究的模型。这样的模型可用于疗法例如抗病毒疗法等的开发。本发明的诱导肝细胞提供恒定的肝细胞来源用于研究用途。可以在体外培养肝炎病毒感染的诱导肝细胞并且研究可考察疾病进展和病毒生命周期。病毒感染的诱导肝细胞还可以用于筛选例如使病毒生命周期停止、杀灭病毒、或消除来自诱导肝细胞的病毒的药物活性剂和化合物；这些筛选还可以提供关于多种药物活性剂和化合物的细胞毒性的信息。

在其它实施方案中，通过产生用于基于自体细胞的疗法的诱导肝细胞，本发明的诱导肝细胞可用于遗传修正(参见，例如，Yusa等人,(2011)Nature 478:391-394)。

本发明所提供的衍生自非肝细胞的细胞群的诱导肝细胞可在多种研究和临床引用中找到有利的用途，包括例如，吸收、分布、代谢、排泄和毒性研究以及治疗性肝脏再生。本发明提供诱导肝细胞群，其可用于治疗多种退行性肝病或肝功能的遗传性或获得性缺陷。由于肝脏控制药物(例如小分子药物)的清除和代谢，本发明提供的诱导肝细胞可用于评价和/或建模候选药物和治疗剂对肝细胞的体内效果。

在其它实施方案中，本发明的诱导肝细胞可用于生物标志物鉴定。这些用途包括使用已知的预测肝脏毒性或效力的生物标志物，鉴定预测肝脏毒性或效力的新的生物标志物，以及在多种临床研究中应用这些新的生物标志物用于通过鉴定和关联诱导肝细胞的生物标志物表达来鉴定会响应于或可能会响应于多种治疗的那些患者或患者组(例如，个体亚群)，其中一种或多种生物标志物可鉴定个体是否会对治疗有积极响应或消极响应。在此用途的多个方面，从衍生自考虑治疗的患者的非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。

基于细胞的疗法

本发明的诱导肝细胞或诱导肝细胞群可以用于多种治疗方法，例如具有受损或机能失调的肝组织或肝脏疾病的患者的治疗。

本发明的诱导肝细胞或诱导肝细胞群还可以用于制造用于治疗受损或机能失调的肝组织的药物。具有受损或机能失调的肝组织或肝脏疾病的个体可能患有肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌、非酒精性脂肪肝病、药物诱导的肝损伤、酒精性肝病、自身免疫性肝病、或遗传性肝脏代谢病症，例如α1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖原贮积症、家族性高胆固醇血症等。本发明在本文中考虑诱导肝细胞用于治疗这些肝脏病症的用途。

诱导肝细胞用于治疗性肝再生的用途相较于用于治疗肝脏疾病的现有的细胞疗法程序提供巨大的改进，所述现有的细胞疗法程序利用供体肝脏(即，肝移植)或得自供体肝脏的细胞。本发明提供可开发用于此类治疗的诱导肝细胞来源。使用从得自患者的非肝细胞的细胞产生的诱导肝细胞的一个优势在于消除了受体的免疫介导的排斥。

在一些实施方案中，本发明提供治疗受损或机能失调的肝组织或肝脏疾病的方法，所述方法包含向有需要的患者施用通过本文所述方法得到的诱导肝细胞群，从而对患者中受损或机能失调的肝组织或肝脏疾病提供治疗。可以通过移植、输注或施用到患者肝脏中，将诱导肝细胞群施用到有需要的患者中。

实施例

以下是本发明方法和组合物的实例。应当理解，在给与以上提供的一般描述的情况下，可以实践多种其它实施方案。

方法和材料

细胞培养

在含有10％HyClone FBS(Thermo Scientific，Waltham，MA)、1％胰岛素-转铁蛋白-硒(Invitrogen)、1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和5mM HEPES缓冲液的DMEM/F12+Glutamax介质(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养BJ成纤维细胞(人原代包皮成纤维细胞，Stemgent，Cambridge，MA)和MRC-5成纤维细胞(人胎儿肺成纤维细胞，ATCC Cat.No.CCL-171)。在两天扩大培养之后，将成纤维细胞用0.5％Trypsin-EDTA(Invitrogen)解离，并以1000细胞/cm²铺板于Collagen-I涂布的组织培养板(BD Biosciences，San Jose，CA)上用于后续重编程实验。对于重编程实验，对细胞培养基补充20ng/ml人肝细胞生长因子(HGF)，20ng/ml表皮生长因子(EGF)，20ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)，200ng/mL B18R(eBioscience，San Diego，CA)，和0.1μM地塞米松(Sigma)。所有细胞培养在无抗生素的培养基中进行。

DNA模板构建用于体外转录(IVT)

使用以前描述的PCR扩增和DNA连接方法的改良版进行DNA模板构建用于体外转录反应(参见Warren等人(2010)Cell Stem Cell7:618-630)。在Genentech寡核苷酸合成核心设施合成寡核苷酸，包括引物、夹板(splint)和UTR。在寡核苷酸合成时将正向ORF引物进行3’磷酸化，并将3’UTR进行5’磷酸化，以使连接效率最大化。

编码Foxa1、Foxa2、Foxa3、Hnf4α、Hnf1α、和Gata4的DNA的开放阅读框(ORF)PCR扩增以含有各个人ORF(Origene，Rockville，MD)中每一者的DNA质粒为模板。用于各ORF PCR扩增的寡核苷酸引物的序列在以下表1中示出。

表1

在ORF PCR扩增后，然后通过DNA连接酶(ampligase)将含有非翻译区(UTR)的寡核苷酸接到ORF PCR扩增产物的上链，这通过使扩增产物退火到夹板寡核苷酸而介导，这使得期望的单链DNA端在一起。用于DNA连接的夹板寡核苷酸的序列示于以下表2中。

表2

所使用的5’-UTR和3’-UTR的序列如下(参见Warrant等人,(2010)Cell Stem Cell 7:618-630)。

5'-UTR:TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATG(SEQ ID NO:29)；

3'-UTR：

GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAGTGAGGGTCTAGAACTAGTGTCGACGC(SEQ ID NO:30).

使用上述方法得到的连接产物然后利用正向和反向加尾寡核苷酸引物进行扩增，这扩增了上述连接产物同时加polyA+尾。所使用的正向和反向加尾引物序列在以下表3中示出。

表3

NLS-GFP(被改造为含有核定位序列(NLS)的绿色荧光蛋白(GFP))的ORF PCR扩增以pturboGFP质粒(Evrogen through Axxora,Richmond,VA)为模板。使用改造的正向引物(如上表2中所示，SEQ IDNO:27)将NLS-GFP的核定位序列加到GFP的N-末端。

使用QIAquick PCR纯化柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化中间ORFPCR扩增产物和连接产物。最终的模板PCR扩增产物在1.2％琼脂糖SYBR E-Gel(Invitrogen)上分离。从凝胶中切出正确长度的条带，并顺序使用QIAquick Gel Extraction和QIAquick PCR纯化柱(Qiagen)进行纯化。如下所述分离并纯化的模板随后被用于修饰的mRNA的合成。

mRNA合成

使用MEGAscript T7试剂盒(Ambion,Austin,TX)通过体外转录(IVT)来合成mRNA，在各个40μl反应中用1.5μg DNA模板。为了合成具有降低的免疫原性和提高的稳定性的mRNA分子，在IVT反应中使用修饰的核糖核苷混合物，如之前所记载(Warren等人(2010)见上文)。IVT反应混合物中核糖核苷的最终浓度如下：7.5mM ATP，7.5mM假-UTP，7.5mM甲基-CTP，1.5mM GTP和6mM ARCA。假-UTP、甲基-CTP和ARCA自TriLink BioTechnologies(San Diego，CA)获得；ATP和GTP自Affymetrix(Santa Clara,CA)获得。

使体外转录反应在30℃下进行14-16小时或在37℃下进行3-6小时，接着用DNase按制造商所述的进行处理。所得的mRNA由此含有至少120A的polyA+尾(SEQ ID NO:66)(通过使用T₁₂₀-带尾引物而并入；参见表3，SEQ ID NO:32；“T₁₂₀”公布为SEQ ID NO:65))和5’抗-反向帽类似物(ARCA)以帮助招募核糖体起始复合体。至少120A的polyA+尾(SEQ ID NO:66)和ARCA都保护所得mRNA使其在转染到细胞内后免受内切酶作用和降解。将RNA纯化，用磷酸酶处理以移除剩余的5’磷酸基，然后再纯化。将MEGAclear试剂盒(Ambion)用于所有的IVT mRNA纯化。以Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)使用RNA 6000Pico试剂盒对RNA长度和纯度进行评价。通过Nanodrop(Thermo Scientific)确定RNA浓度，并通过添加无核酸酶的水(Ambion)将其调节至200ng/μl储液浓度。将编码GFP的mRNA用于非核的GFP转染(Maxcyte,Gaithersburg,MD)。

RNA转染

将TransIT-mRNA(Mirus Bio,Madison,WI)阳离子脂质试剂用于将mRNA转染到细胞中。在转染之前，将mRNA在Opti-MEM ReducedSerum Media(Invitrogen)中稀释20倍，并以每微克RNA 2μl加入BOOST试剂,之后以每微克RNA 2μl TransIT-mRNA试剂的比率添加TransIT-mRNA试剂。将所得的RNA-脂质复合体在室温下孵育3分钟，然后递送到细胞。在将mRNA转染到细胞内前即刻改变细胞培养基。

免疫染色

将细胞在4％甲醛中固定15分钟，并用PBS洗涤3次，持续5分钟。然后将细胞在室温下在含有0.3％Triton X-100(Sigma)的5％山羊血清(Cell Signaling,Dansvers,MA)或5％驴血清(Sigma,St.Louis,MO)中封闭1小时。将细胞在1％BSA(Sigma)和0.3％Triton X-100中于室温下与一抗孵育2小时，并于室温下将其与二抗孵育1小时。在一抗孵育之后用PBS将细胞洗涤3次，持续5分钟。

用于免疫染色的抗体如下：Foxa1(Abcam,Cambridge,MA)、Foxa2(Cell Signaling)和Foxa3(Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA)一抗以1:50稀释使用；Hnf4α(Cell Signaling)、Hnf1α(BD Biosciences)和白蛋白(Abnova,Walnut,CA)一抗以1:100稀释使用；Gata4(BDBiosciences)和甲胎蛋白(AFP)(Sigma)一抗以1:200稀释使用。抗小鼠IgG、抗兔IgG和抗山羊IgG Alexa Fluor 488和555二抗(Invitrogen)以1:1000稀释使用。HCS LipidTOX Neutral Lipids Stain(Invitrogen)按制造商指导用于脂滴染色。Hoechst 33342(Invitrogen)以1μg/ml用于细胞核染色。使用IX81倒置显微镜(Olympus,Center Valley,PA)摄取图像。

qPCR

定量PCR(qPCR)如下进行。按照制造商的说明书使用Cells-to-Ct试剂盒(Ambion)用于RNA提取，并将其中22.5μl留以进行50μl qPCR反应。对于实施例8中记载的实验，使用miRNeasy小量提取试剂盒(Qiagen)直接从细胞培养物分离RNA。将来自各样品的1μg RNA用于Cells-to-Ct试剂盒(Ambion)的50μl qPCR反应。在qPCR反应之前，根据各制造商的说明书用DNase处理RNA样品。对于qPCR，以无UNG的Taqman Universal Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)在20μl反应中使用4μl的各qPCR。使用的引物/探针为如下的20xTaqman基因表达测定(Applied Biosystems)：ABCB1(Hs01067802_m1)，ABCB11(Hs00184824_m1)，ABCG2(Hs01053790_m1)，AFM(Hs00265717_m1)，AFP(甲胎蛋白；Hs01040601_m1)，ALB(白蛋白；Hs00910225_m1)，ALB(白蛋白；Hs00609411_m)，B2M(Hs00984230_m1)，CD106(Hs01003372_m1)，CD13(Hs00174265_m1)，CD133(Hs01009250_m1)，CD26(Hs00175210_m1)，CD29(Hs00559595_m1)，CD36(Hs00169627_m1)，CD44(Hs01075861_m1)，CD73(Hs00159686_m1)，CD9(Hs00233521_m1)，CD90(Hs00174816_m1)，CDH2(Hs00983056_m1)，CXCR4(Hs00237052_m1)，CYP1A2(Hs00167927_m1)，CYP2C19(Hs00426380_m1)，CYP2C8(Hs02383390_s1)，CYP2C9(Hs00426397_m1)，CYP2D6(Hs00164385_m1)，CYP2E1(Hs00559368_m1)，CYP3A4(Hs00256159_m1)，CYP3A7(Hs00426361_m1)，CYP7A1(Hs00167982_m1)，DES(Hs00157258_m1)，DLK1(Hs00171584_m1)，EGFR(Hs00193306_m1)，FABP1(Hs00155026_m1)，FGFR4(Hs00242558_m1)，FOXA1(Hs04187555_m1)，FOXA2(Hs00232764_m1)，FOXA3(Hs00270130_m1)，GAPDH(Hs03929097_g1)，GATA4(Hs00171403_m1)，GPC3(Hs00170471_m1)，GSTA1(Hs00275575_m1)，HNF1A(Hs00167041_m1)，HNF4A(Hs00230853_m1)，ICAM1(Hs00164932_m1)，IGF2(Hs01005970_m1)，IL6R(Hs00794121_m1)，KRT15(Hs00267035_m1)，KRT18(细胞角蛋白-18，ck18；Hs01941416_g1)，KRT19(Hs00761767_s1)，KRT8(Hs01630795_s1)，MET(Hs00179845_m1)，NNMT(Hs00196287_m1)，OSMR(Hs00384276_m1)，RPL19(Hs02338565_gH)，SERPINA1(α1-抗胰蛋白酶；Hs01097800_m1)，SERPINA3(Hs00153674_m1)，SLCO1B3(Hs00251986_m1)，SLCO2B1(Hs00200670_m1)，TTR(Hs00174914_m1)和UGT2B4(Hs02383831_s1)。

RPL19(Hs02338565_gH)用于内源对照测定。使用ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems)来执行并分析qPCR。如果检测不到样品中的基因表达，则应用人工循环阈值41以允许进行比较。

重编程实验

重编程实验大体如下进行。初始的重编程实验使用含有六种不同mRNA的mRNA池，该六种不同的mRNA编码以下六种转录因子：FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4。该含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的六转录因子池在文中被称为6TF。这些研究中使用的6TF mRNA混合物含有摩尔比为1:1:1:1:1:1的mRNA分子。在每日的相同时间每日一次地将每6孔板大约1,200ng mRNA的总剂量转染到培养细胞中，持续指定天数，除非另外指明(参见以下表4)

在使用转录因子混合物的多种组合的实验中，编码转录因子的各个单独mRNA的最终量(而不是最终的总mRNA含量)在实施例11和14中保持恒定。最终的总mRNA含量(而不是各个单独因子的最终量)在实施例12和13中保持恒定。用于减除和添加实验的mRNA池的每日转染所使用的精确转录因子组成以及mRNA用量示于以下实施例中(参见以下表5、6、7和8)。

实施例1：蛋白质表达与转染的mRNA的剂量相关联

进行初步实验以检视多种剂量的转染的mRNA对于转染到人成纤维细胞中之后各蛋白质表达和定位的影响。将多种量的编码绿色荧光蛋白(GFP)或核定位-GFP(NLS-GFP)的IVT mRNA(大约80ng、200ng、500ng和1,000ng，如上所述进行制备)如上所述转染到在24-孔组织培养板中生长的BJ成纤维细胞中。细胞用指定量的RNA转染一次，再培养24小时。使用上述方法确定GFP的表达。

如图1所示，在用编码GFP(在图1中标记为细胞质GFP)或含有核定位序列的GFP(NLS-GFP，在图1中标记为核GFP)的mRNA转染的人成纤维细胞中的GFP表达显示出与转染的mRNA量相关联的剂量响应的蛋白质表达。另外，向GFP mRNA的N端添加核定位序列引起所表达GFP蛋白质的适当的核定位。这些结果表明，可以以剂量依赖的方式对由单独mRNA编码的转录因子的表达程度加以调节。

实施例2：用六转录因子mRNA混合物每日转染成纤维细胞之后的转录因子表达

为检视在mRNA转染到人成纤维细胞中之后转录因子表达维持的程度，进行以下研究。通过以1:1:1:1:1:1的摩尔比汇集如上所述体外转录的6转录因子(6TF)mRNA(编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4)，来制备mRNA混合物。如上所述，将此6TF mRNA混合物每日一次地转染(含有大约1,200ng总mRNA/转染/6孔培养板)到在6孔培养板中培养的BJ成纤维细胞中，持续9天(参见以下表4，列出了6TF mRNA混合物内各种mRNA的量)。9天后，使用上述方法通过qPCR测量各转录因子的表达，并与在未转染的BJ成纤维细胞(例如，仅脂质对照转染的细胞)中各转录因子的表达进行比较。

表4

转录因子	ng mRNA
		FOXA1	200
FOXA2	197
		FOXA3	156
HNF4A	201
		HNF1A	257
GATA4	189
		总(ng)转染的mRNA/孔	1,200

如图2所示，升高的编码多种重编程因子的转录因子mRNA水平在用含有等摩尔量的各转录因子mRNA的6TF mRNA混合物每日一次地转染的细胞中得以维持。这些结果表明，6TF mRNA混合物(如上所述)被一致地递送到所培养的人BJ成纤维细胞中。在这些实验的9天期间没有观察到细胞生存力损失和对抗持续的mRNA递送和暴露的免疫原性(数据未示出)。

实施例3：转录因子定位到用六转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中的细胞核

为了检视用6TF mRNA混合物转染的细胞内的转录因子的细胞定位，进行以下研究。如上所述用6TF mRNA混合物转染BJ成纤维细胞一次。在24小时之后，使用上述方法通过免疫染色来确定各转录因子的细胞定位和定性的蛋白质表达。图3显示在将6TF mRNA混合物转染到BJ成纤维细胞中之后GATA4、HNF1A、HNF4A、FOXA3、FOXA2和FOXA1的免疫染色。如图3所示，检测到GATA4、HNF1A、HNF4A、FOXA3、FOXA2和FOXA1蛋白质表达且其定位到转染细胞的细胞核。在每日一次转染持续5天的细胞中得到了相似的定位结果。这些结果表明，转录因子得以表达并正确定位到转染细胞的细胞核。

实施例4：在用六转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白的诱导

白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)是几乎专有地在肝细胞系的细胞中表达的基因。在非肝细胞的细胞(例如，在人成纤维细胞中)的白蛋白或甲胎蛋白表达的诱导因此可被用作指示这些细胞发展成或被重编程为诱导肝细胞表型的衡量。为了检视人成纤维细胞的6TF mRNA转染对于白蛋白和甲胎蛋白基因表达诱导的作用，进行以下研究。如上所述用6TFmRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞。在5天和9天后，使用如上所述的方法通过qPCR确定细胞中白蛋白和甲胎蛋白的基因表达水平。

9日转染实验的结果显示于图4中，其显示在生物复样(来自两个单独的组织培养孔，标记为iHep1和iHep2)中白蛋白和甲胎蛋白基因表达的变化。图4所示的结果呈现为相对于在未转染的对照细胞中所观察结果的白蛋白和甲胎蛋白基因表达的倍率增加，其中在对照细胞中完全没检测到甲胎蛋白并应用人工循环阈值(在图4中对照细胞标记为Fib)。

如图4所示，与在未转染的对照成纤维细胞中这些基因的表达水平相比，在用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白的基因表达水平被大幅诱导。在未转染的对照细胞中，白蛋白和甲胎蛋白基因表达分别为极低或者检测不到。这些结果显示，用含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的mRNA混合物转染非肝细胞的细胞(例如人成纤维细胞)足以在人成纤维细胞中诱导肝细胞特异性基因(例如白蛋白和甲胎蛋白)的表达。这些结果还表明，含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的6TF mRNA混合物含有能够在非肝细胞的人成纤维细胞中诱导肝细胞特异性基因的表达，并因此能够将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的至少一种重编程因子或重编程因子的组合。

在用6TF mRNA混合物每日一次地转染持续5天的细胞中观察到相似的结果(数据未示出)。

实施例5：转染的人成纤维细胞中的白蛋白和甲胎蛋白诱导与重编程因子表达相关联

为检视重编程因子表达与肝细胞特异性基因表达诱导之间的关联，进行以下研究。如上所述用6TF mRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞。6天后，如上所述使用免疫染色评价转染细胞的FOXA2和甲胎蛋白表达。

图5显示用6TF mRNA混合物转染6天的人成纤维细胞中的FOXA2和甲胎蛋白(AFP)的免疫染色结果。如图5所示，大部分转染的细胞显示出FOXA2蛋白质的核表达。在细胞的FOXA2阳性群体中，存在表现出甲胎蛋白胞质表达的细胞群体。经载体转染的成纤维细胞未表现出FOXA2或甲胎蛋白表达。这些结果表明，6TF mRNA转染之后的甲胎蛋白诱导与转染的细胞的独特群体相关联并与FOXA2表达相关联，意味着甲胎蛋白诱导对于真正的重编程事件是特异性的。

图6显示用6TF mRNA混合物转染5天的人成纤维细胞中的白蛋白免疫染色结果。如图6所示，存在表现出白蛋白胞质表达的细胞群体。经载体转染的成纤维细胞未表现出白蛋白表达。在每日一次地转染6TF mRNA混合物持续5天后的人成纤维细胞中诱导的白蛋白表达指示着人成纤维细胞快速重编程为诱导肝细胞。

总的来说，这些结果意味着观察到的甲胎蛋白和白蛋白表达的诱导不是因为整体的基础上调，而是因为诱导肝细胞的独特群体。为使甲胎蛋白和白蛋白的蛋白质表达在独特细胞中以这样的水平发生，少量群体的细胞必须已激活内源肝细胞特异性转录回路，指示着真实且稳定的重编程事件在成纤维细胞的表观基因组中发生，引起肝细胞特异性启动子和转录控制元件的激活，例如与甲胎蛋白和白蛋白表达相关联的那些。

实施例6：在用六转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中α1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、δ样蛋白1基因表达的诱导

α1-抗胰蛋白酶(A1AT)是近乎专有性地在肝细胞中表达的蛋白酶抑制剂。A1AT已被用作胚胎干细胞(ESC)肝细胞分化中的成熟功能性肝细胞的标志物。细胞角蛋白18(CK18)是相较于其他组织在肝脏中高表达的细胞骨架结构蛋白。δ样蛋白1(DLK1)是其表达高度特异于胎儿肝脏并且已被显示为肝脏干细胞的标志物的细胞表面蛋白质。此外，DLK1和CK18可以用作诱导肝细胞富集的表面标志物。在非肝细胞的细胞中A1AT、CK18和DLK1表达的诱导因此可被用作指示着非肝细胞的细胞发展成或被重编程为诱导肝细胞表型的衡量。

为了检视对人成纤维细胞转染6TF mRNA对于A1AT、CK18和DLK1基因表达的诱导或增加的影响，进行以下研究。如上所述，用6TF mRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞。9天后，如上所述，使用qPCR确定细胞中A1AT、CK18和DLK1的基因表达水平。如图7所示，与在非肝细胞的对照细胞中所观察的相比，在用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞中A1AT、CK18和DLK1的基因表达水平增加。具体地，A1AT基因表达水平增加大约5倍，而CK18和DLK1基因表达水平增加大约3倍，超过在未转染的对照成纤维细胞中其各自的基因表达水平。这些结果表明，用六转录因子mRNA(其包括编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA)的混合物转染人成纤维细胞引起成纤维细胞中的表型变化，包括关键肝细胞功能性(A1AT)、结构性(CK18)和表面标志物(DLK1)基因的诱导。

这些结果还表明，含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的6TF mRNA混合物含有能够在非肝细胞的人成纤维细胞中诱导肝细胞特异性基因的表达，并因此能够将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的至少一种重编程因子或重编程因子的组合。

实施例7：在用六转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中肝细胞形态的诱导

仅在很少的哺乳动物细胞类型中观察到多核化，包括肝细胞、巨核细胞和肌细胞。尽管巨核细胞和肌细胞经常具有多于2个的细胞核存在于单细胞中，但双核化(即，单个细胞中存在2个细胞核)是肝细胞的独特形态特征。相比之下，成纤维细胞不是双核化的，除非是处于非常特定的条件下(例如，如果胞质分裂用细胞松弛素B阻断)。

为检视在用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞中多核化的形态变化和发展，进行以下实验。如上所述，用6TF mRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞。9天后，检查转染的细胞的细胞形态变化。如图8所示，BJ成纤维细胞在对其用6TF mRNA混合物转染后表现出肝细胞样的形态。具体而言，转染的成纤维细胞表现出双核化(即，细胞变得双核化)，这是肝细胞而非成纤维细胞的独特形态特征。

此外，用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞显示出广泛的液泡，这是对于肝细胞常见而非成纤维细胞的形态特征。这些形态变化意味着转染的人成纤维细胞被重编程为诱导肝细胞表型。汇总言之，这些结果显示，用六转录因子mRNA(编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4)的混合物转染人成纤维细胞导致成纤维细胞经历成纤维细胞中的形态学和表型变化，特别是双核化和广泛的液泡形成。

这些结果还表明，含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的6TF mRNA混合物含有能够诱导非肝细胞的人成纤维细胞中肝细胞特异性的形态学和表型变化并因此能够指导人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的至少一种重编程因子或重编程因子的组合。

实施例8：在用六转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中脂滴的形成

脂滴是用于存储中性脂质的细胞器。在脂滴中存储中性脂质是成熟肝细胞的功能特征而不是成纤维细胞的功能特征。为研究用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞中脂滴的出现，进行以下实验。如上所述，用6TFmRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞。6天后，就脂滴存在对转染的细胞染色。

图9显示在用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞中具有高中性脂质含量表现为脂滴的独特细胞。在未转染的人成纤维细胞(载体对照)中未观察到脂滴。这些结果表明，用6TF mRNA混合物转染人成纤维细胞导致成纤维细胞重编程为诱导肝细胞功能性表型。这些结果还表明，含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的6TF mRNA混合物含有能够在非肝细胞的人成纤维细胞诱导肝细胞功能性表型并因此能够指导体细胞重编程为诱导肝细胞的至少一种重编程因子或重编程因子的组合。

实施例9.在用六转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白的诱导

为了检视用6TF mRNA转染人胎儿肺成纤维细胞对于白蛋白和AFP基因表达的诱导的作用，进行以下研究。用6TF mRNA混合物转染MRC-5成纤维细胞，每日一次持续7天。以下表5提供6TF mRNA混合物中所包含的各种mRNA的ng量。7天后，使用如上所述的方法通过qPCR确定细胞中白蛋白和AFP的基因表达水平。

表5

转录因子	ng mRNA
		FOXA1	83
FOXA2	82
		FOXA3	65
HNF4A	84
		HNF1A	107

GATA4	79
		总(ng)转染的mRNA/孔	500

这些实验的结果示于图10中，其显示白蛋白和AFP基因表达的变化。图10的结果呈现为相较于在未转染的对照细胞(在图10中对照细胞标记为Fetal Fib)中所观察到的白蛋白和AFP基因表达的倍率增加。

如图10所示，与在未转染的对照成纤维细胞中这些基因的表达水平相比，在用6TF mRNA混合物转染的人胎儿肺成纤维细胞中白蛋白和AFP的基因表达水平得以诱导。如在BJ成纤维细胞(参见以上实施例4)中所观察的，在未转染的对照MRC-5成纤维细胞中，白蛋白和AFP基因表达极低或者检测不到。汇总言之，这些结果显示，用含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的mRNA混合物转染非肝细胞的细胞(例如，人胎儿肺成纤维细胞和人包皮成纤维细胞)足以在多种人成纤维细胞中诱导肝细胞特异性基因(例如，白蛋白和AFP)的表达。这些结果还表明，含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的6TF mRNA混合物含有能够在非肝细胞的人成纤维细胞诱导肝细胞特异性基因表达并因此能够将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的至少一种重编程因子或重编程因子组合。

实施例10：HNF1A是用于将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的必需因子

为进一步探究将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞所需或与之相关联的转录因子，进行下组的减除实验。制备多种转录因子mRNA混合物，其中6TF mRNA混合物(含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A、HNF1A和GATA4的mRNA的6TF mRNA混合物)中的一种转录因子未包含在各个最终的五转录因子(5TF)mRNA混合物中。在此系列实验中使用的5TF mRNA混合物含有6TF混合物减去FOXA1(6TF-FOXA1)，减去FOXA2(6TF-FOXA2)，减去FOXA3(6TF-FOXA3)，减去HNF4A(6TF-HNF4A)，减去HNF1A(6TF-HNF1A)，或减去GATA4(6TF-GATA4)。对于各个5TF mRNA混合物和在各个mRNA混合物中所包含的mRNA的ng量的列表，参见以下表6。

表6

表6:用于此系列减除实验的池组成和RNA转染量。所有数值表示用于一个6孔板中各个每日转染剂量的各mRNA的ng量。细胞转染进行5个连续日。

用6TF mRNA混合物(对于6TF mRNA混合物组成，参见以上表6)或各个5TF mRNA混合物(如上所述并示于表6中)每日一次地转染BJ成纤维细胞，如上所述进行5个连续日。5天后，使用如上所述的方法通过qPCR确定细胞中白蛋白和AFP的基因表达水平。数据呈现为在用各个mRNA混合物(参见表6，其中在各个mRNA混合物中未包含编码一种转录因子的mRNA)转染的细胞中测得的白蛋白或AFP基因表达水平相较于在用完整的6TF mRNA混合物转染的细胞中所测结果的倍数变化。

如图11A和11B所示，用mRNA混合物6TF-FOXA1、6TF-FOXA2、6TF-FOXA3、6TF-HNF4α、或6TF-GATA4转染的人成纤维细胞显示出与在用完整的6TF mRNA混合物转染的细胞中所观察到的可比较的或更高的白蛋白和AFP基因表达水平。

图11A和11B还显示，与在用完整的6TF mRNA混合物转染的细胞中的这些基因的表达水平相比，用6TF-HNF1A mRNA混合物转染的人成纤维细胞显示更低的白蛋白和AFP基因表达水平。该数据意味着HNF1A对于将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞是必需的转录因子。

这些结果与之前关于将小鼠成纤维细胞重编程为诱导肝细胞所报道的那些不同，指示着与人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的机制以及对于人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞而言必需且充足的因子不同于与小鼠成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的那些(参见Huang等人,(2011)Nature 475:386-389；和Sekiya和Suzuki(2011)Nature 475:390-393)。Huang鉴定了Gata4、Hnf1α和Foxa3的组合(连同p19^Arf的失活)足以诱导鼠科动物肝向转化；Sekiya和Suzuki鉴定了诱导鼠科动物肝向转化的两种转录因子的三种特定组合，包括Hnf4α加Foxa1、Foxa2或Foxa3。

实施例11：在用多种转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中的白蛋白和AFP基因表达

为进一步探究将人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞所必需或与之相关联的转录因子，如下进行另外的减除实验。制备多种转录因子mRNA混合物，其中6TF-GATA4mRNA混合物(含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A和HNF1A的mRNA的5TF mRNA混合物)中的一种转录因子未包含在各个最终的四转录因子(4TF)mRNA混合物中。在此系列的实验中使用的4TF mRNA混合物含有5TF mRNA混合物减去FOXA1(5TF-FOXA1)，减去FOXA2(5TF-FOXA2)，减去FOXA3(5TF-FOXA3)，减去HNF4α(5TF-HNF4α)，或减去HNF1α(5TF-HNF1α)。以下表7提供各个4TF mRNA混合物的组分和在各个mRNA混合物中所包含的mRNA的ng量的列表。

表7

表7:用于此系列减除实验的池组成和RNA转染量。5TF mRNA混合物是无Gata4的6TF。所有数值表示用于一个孔(12孔板)中各个每日转染剂量的各mRNA的ng量。细胞转染进行5个连续日。

在这些实验中，将在12孔组织培养板中培养的BJ成纤维细胞用于转染，每12孔组织培养板转染的mRNA总量为大约500ng。用表7所示的6TF mRNA混合物、6TF-GATA4mRNA混合物或各个4TF mRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞，如上所述进行5个连续日。5天后，使用如上所述的方法通过qPCR确定转染和对照细胞中白蛋白和AFP的基因表达水平。数据呈现为在用各个mRNA混合物转染的细胞中测得的白蛋白或AFP基因表达水平相较于在用6TF-GATA4mRNA混合物(在图12A和12B中标记为5TF)转染的细胞中所测的倍数变化，所述6TF-GATA4mRNA混合物含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A和HNF4A的mRNA，但不含编码GATA4的mRNA。

如图12A和12B所示，白蛋白或AFP基因表达的诱导程度在用6TFmRNA混合物转染的人成纤维细胞中与在用6TF-GATA4mRNA混合物转染的人成纤维细胞中所观察到的相比较是相似的。这些结果意味着，Gata4可能不是与人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的关键重编程因子。

与以上实施例10中所描述的实验数据一致，图12A和12B呈现的结果显示，HNF1A是使人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的必需因子。具体而言，与在用其它4TF mRNA混合物(即5TF-FOXA1、5TF-FOXA2、5TF-FOXA3、5TF-HNF4A、或5TF-HNF1A)中任一种转染的人成纤维细胞中所观察到的相比，用5TF-HNF1A转染的人成纤维细胞显示更低的白蛋白和AFP基因表达水平。此外，相较于用其它mRNA混合物转染的细胞，白蛋白和AFP基因表达水平在用5TF-HNF4A转染的人成纤维细胞中也更低。此数据意味着，至少在不存在GATA4时，HNF4A是使人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的必需因子。

这些结果与之前关于使小鼠成纤维细胞重编程为诱导肝细胞所报道的那些不同，指示着与人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的机制以及对于人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞而言必需且充足的因子不同于与小鼠成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的那些(参见Huang等人,(2011)Nature 475:386-389；和Sekiya和Suzuki(2011)Nature 475:390-393)。Huang鉴定了Gata4、Hnf1α和Foxa3的组合(连同p19^Arf的失活)足以诱导鼠科动物肝向转化；Sekiya和Suzuki鉴定了诱导鼠科动物肝向转化的两种转录因子的三种特定组合，包括Hnf4α加Foxa1、Foxa2或Foxa3。

实施例12：在用多种转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中的白蛋白和AFP基因表达

通过如下进行另外的减除实验来进一步研究以上在实施例10和11中描述的观察结果。制备多种转录因子mRNA混合物，其中5TF-FOXA2mRNA混合物(含有编码FOXA1、FOXA3、HNF4A和HNF1A的mRNA的4TF mRNA混合物)中的一种转录因子未包含在各个最终的三转录因子(3TF)mRNA混合物中。在此系列的实验中使用的3TF mRNA混合物含有5TF-FOXA2mRNA混合物减去FOXA1(4TF-FOXA1)，减去FOXA3(4TF-FOXA3)，减去HNF4A(4TF-HNF4A)，或减去HNF1A(4TF-HNF1A)。以下表8提供6FT、4TF和各个3TF mRNA混合物的组分以及在各个mRNA混合物中所包含的mRNA的ng量的列表。

表8

表8：用于此系列减除实验的池组成和RNA转染量。4TF混合物是没有Gata4和Foxa2的6TF。所有数值表示用于每12孔组织培养板的各个每日转染剂量的各mRNA的ng量。细胞每日转染一次，进行5个连续日。

在这些实验中，将在12孔组织培养板中培养的BJ成纤维细胞用于转染，每12孔组织培养板转染的mRNA总量为500ng。用表8所示的6TFmRNA混合物、4TF mRNA混合物或各个3TF mRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞，如上所述进行5个连续日。5天后，使用如上所述的方法通过qPCR确定转染细胞中白蛋白和AFP的基因表达水平。数据呈现为在用各个mRNA混合物转染的细胞中测得的白蛋白或AFP基因表达水平相较于在用4TF mRNA混合物转染的细胞中所测结果的倍数变化，所述4TF mRNA混合物含有编码FOXA1、FOXA3、HNF1A和HNF4A的mRNA，但不含编码GATA4或FOXA2的mRNA。

如图13A和13B所示，用4TF mRNA混合物(含有编码FOXA1、FOXA3、HNF1A和HNF4A的mRNA)转染的人成纤维细胞表现出与在用6TF mRNA混合物(含有编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A和GATA4的mRNA)转染的人成纤维细胞中所观察到的相似的白蛋白和AFP的基因表达水平。这些结果意味着，FOXA1、FOXA3、HNF1A和HNF4A足以指导人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞。

与以上实施例10和11中所描述的实验数据一致，图13A和13B呈现的结果显示，HNF1A是使人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的必需因子。具体而言，与在用其它mRNA混合物中任一种转染的人成纤维细胞中所观察到的相比，用4TF-HNF1A转染的人成纤维细胞显示大大降低的白蛋白和AFP二者的基因表达水平。此外，相较于用其它mRNA混合物转染的细胞，白蛋白基因表达水平在用4TF-HNF1A、4TF-FOXA1或4TF-FOXA3mRNA混合物转染的人成纤维细胞中也更低。此数据意味着，HNF4A、FOXA1和FOXA3是使人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的重要因子。

这些结果与之前关于将小鼠成纤维细胞重编程为诱导肝细胞所报道的那些不同，指示着与人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的机制以及对于人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞而言必需且充足的因子不同于与小鼠成纤维细胞重编程为诱导肝细胞相关联的那些(参见Huang等人,(2011)Nature 475:386-389；和Sekiya和Suzuki(2011)Nature 475:390-393)。Huang鉴定了Gata4、Hnf1α和Foxa3的组合(连同p19^Arf的失活)足以诱导鼠科动物肝向转化；Sekiya和Suzuki鉴定了诱导鼠科动物肝向转化的两转录因子的三种特定组合，包括Hnf4α加Foxa1、Foxa2或Foxa3。

实施例13：在用多种转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中的白蛋白和AFP基因表达

上述实验结果指示着HNF1A是使人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞的必需因子。为进一步探究余下的6TF mRNA中哪一个编码使人成纤维细胞重编程为诱导肝细胞所必需的转录因子，进行下组的添加实验。在这些实验中，mRNA混合物制备为含有编码HNF1A的mRNA或含有编码HNF1A的mRNA加另一种编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF4A或GATA4的mRNA。以下表9提供用于这些实验的各个mRNA混合物的组分和在各个mRNA混合物中所包含的mRNA的ng量的列表。

表9

表9：用于此系列添加实验的池组成和RNA转染量。所有数值表示用于每6孔组织培养板的各个每日转染剂量的各mRNA的ng量。细胞每日转染一次，进行5个连续日。

用表9所示的各个mRNA混合物每日一次地转染6孔组织培养板中的BJ成纤维细胞，如上所述进行5个连续日。5天后，使用如上所述的方法通过qPCR确定转染细胞中的白蛋白和AFP基因表达水平。数据呈现为在用各个mRNA混合物转染的细胞中测得的白蛋白或AFP基因表达水平相较于在单独用HNF1A转染的细胞中所测的倍数变化。

如图14A和14B所示，用仅编码HNF1A的mRNA转染的人成纤维细胞表现出略微高于在未转染的对照成纤维细胞中所观察到的白蛋白和AFP的基因表达水平。图14B还显示，用含有编码HNF1A的mRNA加编码FOXA1、FOXA2、FOXA3或GATA4的mRNA的混合物转染的人成纤维细胞具有高于在用仅编码HNF1A的mRNA转染的细胞中所观察到的AFP基因表达水平。本文所公开的6种转录因子中的单个因子或双因子组合在本文使用的培养条件下均不足以以任何大程度地使这些人成纤维细胞转变成诱导肝细胞。

实施例14.在用11个转录因子mRNA混合物转染的人成纤维细胞中的白蛋白和甲胎蛋白诱导

为了检视人成纤维细胞的11TF mRNA转染对白蛋白和甲胎蛋白诱导的影响，进行以下研究。使用上述方法，用11TF mRNA混合物每日一次地转染MRC-5成纤维细胞5天。5天后，使用上述方法通过qPCR确定细胞中白蛋白和甲胎蛋白(AFP)的基因表达水平。11TF mRNA混合物含有编码C/EBPα、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、GATA6、HHEX、HNF1α、HNF1β、HNF4α和HNF6α的mRNA。

如图27所示，相较于在未转染的载体对照成纤维细胞中白蛋白和甲胎蛋白这些基因(图27中Poly I:C)和蛋白质(图27中Media)的表达水平，白蛋白和甲胎蛋白的基因表达和蛋白质水平在用11TF mRNA混合物转染的人胎儿成纤维细胞中大量诱导。这些结果显示，用含有编码C/EBPα、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、GATA6、HHEX、HNF1α、HNF1β、HNF4α和HNF6α的mRNA的mRNA混合物转染非肝细胞的细胞足以诱导人成纤维细胞中肝细胞特异性基因的表达。

近来的报道显示，TLR3(Toll样受体3，也称为CD283)的活化对于染色质重建和重编程是至关重要的(参见Lee等人,(2012)Cell151:547-558)。进行实验以检视11TF mRNA混合物是否会激活TLR3并确定其它激活是否会增加肝诱导。

进行实验以测试每日补充Poly I:C(一种已知的TLR3激动剂)，伴以11TF mRNA混合物转染是否会进一步增加白蛋白和AFP的表达。结果显示，仅11TF mRNA转染大约2倍高于对照地使TLR3活化(参见图27)。尽管仅Poly I:C时未激活TLR3，但Poly I:C加11TF mRNA转染引起TLR3表达的8倍增加。高于仅11TF mRNA转染时的TLR3表达的这种进一步增加并没有伴随着白蛋白或AFP表达对应的增加，意味着仅mRNA转染就足以激活TLR3用于重编程且不需要其它刺激。

进行实验以比较11TF mRNA混合物与6TF mRNA混合物的重编程潜力。在将11TF mRNA混合物和6TF mRNA混合物每日转染到人新生儿成纤维细胞的2个单独样品中5天时，观察到白蛋白和AFP的上调和激活(参见图28)。有趣的是，相比于用11TF mRNA混合物进行转染，用6TF mRNA混合物进行转染引起大约3倍更高的白蛋白表达和近200倍更高的AFP表达。这些结果表明，6TF mRNA混合物比11TF mRNA混合物更有效地激活沉默的肝细胞特异性基因并诱导成纤维细胞向诱导肝细胞的直接转变。这些结果还意味着在存在于11TF mRNA混合物中但不存在于6TF mRNA混合物中的5种转录因子中的一些具有抑制性作用。

实施例15.多种肝细胞蛋白质的基因表达水平

为进一步表征肝向转化的程度，在用6TF mRNA混合物转染的人成纤维细胞中检视编码若干类的关键肝细胞蛋白质(包括分泌的蛋白质、CYP、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、膜蛋白、细胞角蛋白和转运蛋白)的基因的基因表达水平的变化。将结果与这些基因在原代肝细胞中的表达水平相比较。进行一式两份的实验(在图29A和29B为iHep1和iHep 2)。用6TF mRNA混合物每日一次地转染BJ成纤维细胞(图29A)和MRC-5人成纤维细胞5天。

总体而言，转染细胞中的基因表达水平与在原代肝细胞中所观察到的相随。值得注意地，用6TF转染仅5天后观察到相对高水平的CYP表达(包括CYP3A4)(参见图29A和29B)。在纯原代肝细胞中测得的大多数基因的表达比在6TF-iHep中所观察到的高大约1,000倍，与白蛋白和AFP高表达细胞的频率为1:1,000～1:10,000的先前观察结果一致。

在用6TF mRNA混合物转染后还检视了细胞表面标志物的表达的变化。如图30所示，相较于在载体对照转染的成纤维细胞中所观察到的，细胞表面蛋白CD106、CD133和DLK1显示出增加的基因表达水平。

实施例16.糖皮质激素对于人成纤维细胞直接重编程为诱导肝细胞的影响

许多肝细胞基因只能通过同时结合至糖皮质激素应答元件(GRE)以及特定的转录因子结合位点而激活(Phuc等人,(2005)PLoS Genetics1:e16)。进行研究以检视糖皮质激素受体(GR)和在重编程过程中转染肝脏主转录因子的协同刺激对于肝脏诱导和通过直接的重编程产生诱导肝细胞的成功是否是关键性的。为检视此点，研究了去除地塞米松——一种强GR激动剂对于重编程的影响。

在培养基中存在或不存在地塞米松补充物(或是0.1μM(在图31中为+)——这是培养基中使用的标准浓度，或是1.0μM(在图31中为++))的情况下，用11TF mRNA混合物或6TF mRNA混合物每日一次地转染人成纤维细胞5天。如通过白蛋白基因表达的诱导所测量的，任一地塞米松浓度单独(不同时转染11TF或6TF mRNA混合物)不引起肝脏诱导。然而，当在用6TF mRNA混合物转染期间在培养基中不包含地塞米松时，观察到大约100倍的降低的诱导肝细胞转化率(参见图31)。

这些结果意味着，如所预期的，糖皮质激素受体(GR)激活和与糖皮质激素应答元件结合是导致非肝细胞重编程为诱导肝细胞所需的转录机制的必需组分。有趣的是，使用11TF mRNA混合物重编程的样品并未像对于6TF mRNA混合物所观察到的那样剧烈地受地塞米松去除的影响，仅显示白蛋白5倍降低。这些结果意味着，在11TF mRNA混合物中存在的5种额外转录因子中的一种或多种或间接实现GR激活或是通过不依赖GR的机制帮助肝脏诱导。需要注意的是，地塞米松补充的10倍增加(在图31为++)的10倍增加并未伴随着白蛋白表达的相应增加，并事实上导致略微降低的白蛋白表达，可能是因为在此高浓度下的轻微毒性。这意味着地塞米松在0.1μM的初始浓度下使GR饱和，且没有更多的补充将会是有益的。

实施例17.HNF1α是肝细胞重编程的主调节物

以上实施例10、11、12和13显示在肝细胞重编程中对于一些转录因子(特别是HNF1α)的需求超过其它转录因子。特别地，我们预期HNF1a的重要性是因为缺乏来自6TF mRNA混合物中其它5种转录因子的补偿激活。为测试此点，当从重编程混合物中省去目标转录因子并仅转染其它5种转录因子用于重编程时，测量6TF mRNA混合物中6种转录因子各自的基因表达水平。这将提供各‘缺失的’转录因子多大程度地通过5种余下的转录因子激活而得以补偿的直接衡量。

如图32所示，在6TF转录因子之中HNF1a最低程度地被补偿，其表达增加仅10倍高于人成纤维细胞中的内源性表达水平并且远低于在人原代肝细胞中所观察到的水平。所有其它转录因子都通过各自分别的样品中余下的5种转录因子得以补偿。事实上，除了FOXA3外的所有其它转录因子都通过其它转录因子补偿到这样的程度，即它们升高至在原代肝细胞中观察到的水平(如对于HNF4a而言的情形)，或升高至高更多的水平(如对于FOXA1、FOXA2和GATA4)(参见图32)。这些结果表明，HNF1α可能是负责人细胞中肝细胞诱导的主转录因子。

为进一步检视HNF1a对于肝细胞重编程的重要性，进行大约35种关键肝基因的聚类分析(参见图33)。用于此分析的细胞样品包括成纤维细胞转录因子减除样品(其中从6TF mRNA混合物中去除1种转录因子)、用6TF mRNA混合物转染的成纤维细胞、载体对照样品、原代人肝细胞和HepG2人肝细胞癌细胞系。如所预期的，HepG2细胞聚类最接近原代肝细胞，接着是在异质的6TF样品和大多数减除样品(其包含诱导肝细胞样细胞与成纤维细胞的混合物)中所观察到的。与肝细胞最远的是载体对照样品和缺失HNF1a的减除样品，这二者紧密聚类在一起，因为它们包含非诱导的成纤维细胞。这些结果进一步证实在此组关键肝基因的激活中需要HNF1a，由此引发肝细胞诱导(参见图33)。

实施例18.多种肝细胞蛋白质的基因表达水平

如下进行研究以检视大量肝细胞特异性基因的表达。在这些实验中，用6TF mRNA混合物转染人胎儿BJ-成纤维细胞或MRC5胚胎干细胞。不进行任何后续的转化细胞富集，对重编程的细胞和原代肝细胞进行qPCR以检视和比较33种肝细胞特异性基因的基因表达水平。

如图34A和34B所示，在人胎儿成纤维细胞和在人胚胎干细胞中用6TF mRNA混合物进行转染之后，众多肝细胞特异性基因上调。这些基因包括分泌的蛋白质(例如，FABP1)、酶(例如，CYP3A4)和转运蛋白(例如，ABCB1)。尽管这些基因在重编程细胞中的表达水平不如在原代肝细胞中观察到的强健，但这些结果证实，相较于在对照人胎儿成纤维细胞和人胚胎干细胞中所观察到的，许多肝细胞基因在重编程细胞中上调(参见图34A和34B，其分别显示相对于在载体处理的对照人胎儿成纤维细胞和人胚胎干细胞中所观察结果的基因表达水平的倍数增加)。

实施例19.重编程细胞的转录组和小RNA分析

在6TF mRNA混合物和11TF mRNA混合物中所包括的转录因子不是专有性地在肝细胞中表达；它们的表达也与其它发育相关的组织，特别是内胚层组织相关联(参见，例如Stainier(2002)Genes&Development16:893-907)。为了检视在使用本发明的重编程方法的初始重编程阶段期间出现的其它变化，对用11TF mRNA混合物、6TF mRNA混合物或载体对照重编程5天的人胎儿成纤维细胞进行全转录组和小RNA测序分析(不进行任何后续的转化细胞富集)。

转录组和小RNA测序如下进行。通过miRNAeasy小量试剂盒(Qiagen)提取获得自转染细胞的总RNA样品。转录组测序(4G纯净数据)和小RNA(20mil纯净读数)测序由Beijing Genomics InstituteAmericas(BGI Americas,Cambridge,MA)进行。使用标准BGI工作流程处理RNA样品，所述标准BGI工作流程包括RNA质量评估、文库构建、文库验证、聚类、在Illumina HiSeqTM 2000上测序和标准生物信息学分析。使用p值的Bonferroni校正通过计算对于各基因的错误发现率(FDR)由BGI确定差异性表达的基因的显著性。低于0.001的FDR值被视为显著的。在对log2比率制图的图中，这些值对应于适当的RPKM值的log2。使用组织特异性基因表达和调节(TiGER)数据库鉴定组织特异性的基因。

结果显示，表达的基因偏离对照的平均离散度(md)在用6TF mRNA混合物或11TF mRNA混合物转染的细胞中在方向上是相似的(md＝0.351)，但在6TF(md＝0.932)样品中大于在11TF(md＝0.844)样品中(图35A)。结果显示所表达的小RNA偏离对照的平均离散度(md)在用6TF或11TF mRNA混合物转染的细胞中在方向上是相似的(md＝0.352)，但在6TF(md＝0.752)样品中大于11TF(md＝0.609)样品(图35B)。

这些结果证实了我们的发现(如上所述)：对于将人非肝细胞的细胞重编程为人肝细胞状态(即，重编程为诱导肝细胞)而言，6TF mRNA混合物比11TF mRNA混合物更有效。与对照成纤维细胞相比较，用6TFmRNA混合物转染的人胎儿成纤维细胞的全局基因表达分析显示，肝细胞特异性基因例如FBB、APOA1和SERPINA1从近乎检测不到的水平剧烈上调；成纤维细胞特异性基因例如FSP1、DES和VIM下调；且多能性基因例如OCT4和NANOG未改变(数据未示出)。此外，对于受损期间肝脏修复必要的基因包括CXCL9、CXCL10、CXCL11和ODC1也被激活(数据未示出)。(参见Wasmuth等人,(2009)Gastroenterology 137:309-319和Ohtake等人,(2008)Cell Biochemistry and Function 26:259-365)。

在用6TF mRNA混合物转染的人胎儿肝细胞中肝细胞相关的miRNA也上调。很明显，占超过肝细胞中miRNA总含量的70％的miR-122(Girard等人,(2008)J Hepatology 48:648-656)处于在用6TF mRNA混合物转染的人胎儿成纤维细胞中观察到的最上调的miRNA当中(数据未示出)。

在6TF mRNA转染的样品中前25种最上调的基因中，有12种基因被归为肝脏特异性或肝脏受损相关的，而仅有4种基因与其它内胚层组织相关(参见图36)。有趣的是，这25种最上调的基因中有4种编码组蛋白，其也是全局观察到的趋势，因为相较于在对照细胞中所观察的情形，编码组蛋白的基因在用6TF mRNA混合物转染的非肝细胞的细胞中显著更高地表达(参见图37)。

实施例20.内胚层基因表达

致力于理解在这些早期重编程事件中的组织特异性基因表达的全局变化，使用组织特异性基因表达和调节(TiGER)数据库(Liu等人,(2008)BMC Bioinformatics 9:271)将基因注解为特异于主要内胚层组织(例如，结肠、肝脏、肺、胰腺、小肠和胃)、代表细胞不成熟的胎盘组织和代表成纤维细胞的软组织。在用6TF mRNA混合物转染的人非肝细胞的细胞(人胎儿成纤维细胞)中，注解为肝脏特异性(R²＝0.184)的基因的表达较之对照最为趋异，胰腺特异性基因的表达第二远(R²＝0.488)，且软组织特异性基因的表达保持为近乎不变(R²＝0.860)(数据未示出)。检视上调或下调超过2倍的专有性组织特异性基因反映出，肝脏特异性基因的分散主要是由于基因表达的上调，而特异于其它内胚层组织的基因的分散未遵循特定方向，且软组织基因最下调(参见图38；示于图38的组织的基因表达水平从左至右包括肝脏、胎盘、结肠、胃、肺、小肠、胰腺、软组织)。此外，许多上调的胎盘特异性基因可与胎儿肝脏的基因表达图式相关。尽管程度较轻，在用11TF mRNA混合物转染的人胎儿肝细胞中观察到相似的结果(数据未示出)。汇总言之，这些结果显示，用6TF mRNA混合物转染人非肝细胞的细胞使得较之其它紧密相关的内胚层来源的细胞类型，细胞优先朝着人肝细胞状态重编程且偏离软组织状态。

实施例21.重编程介质

开发显示最优重编程结果的重编程介质；将此介质用于本文描述的重编程实验。通过就激活人CD34+骨髓细胞中肝脏基因的能力筛选大量生长因子、小分子、基础介质和组织培养皿涂层来开发重编程介质，所述CD34+骨髓细胞具有弱肝脏转分化潜力(数据未示出)(参见Jang等人(2004)Nature Cell Biology 6:532-539和Theise等人(2000)Hepatology 32:11-16)。重编程介质含有具有10％HyClone FBS(Thermo Scientific,Waltham,MA)的DMEM/F12+Glutamax介质(Invitrogen,Carlsbad,CA)，1％胰岛素-转铁蛋白-硒(Invitrogen)，1％MEM非必需氨基酸(Invitrogen)和5mM HEPES缓冲液，还补充有20ng/ml人肝细胞生长因子(HGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、20ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)(Peprotech,Rocky Hill,NJ)、200ng/mL B18R(eBioscience,San Diego,CA)和0.1μM地塞米松(Sigma)。所有细胞培养在无抗生素的培养基中进行。

尽管已经出于理解清楚的目的以示例说明和实施例的方式较详细地描述了前述发明，但不应将说明和实施例理解为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容都明确地整体并入本文以作参考。

Claims

1.用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法，所述方法包括提供非肝细胞的细胞，使非肝细胞与增加或诱导一种或多种重编程因子的表达或活性的活性剂接触，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养非肝细胞的细胞，由此从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。

2.用于从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞的方法，所述方法包括提供非肝细胞的细胞，向非肝细胞的细胞中引入编码或提供一种或多种重编程因子的核酸或蛋白质制剂，以及在适合于将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞的条件下培养非肝细胞的细胞，由此从非肝细胞的细胞产生诱导肝细胞。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A所组成的组。

4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述一种或多种重编程因子选自由FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4所组成的组。

5.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A。

6.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4。

7.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

8.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

9.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A。

10.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

11.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、HNF1A、和HNF4A。

12.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

13.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA2、HNF1A、和HNF4A。

14.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、FOXA3、和HNF1A。

15.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA1、FOXA2、和HNF1A。

16.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述重编程因子包含FOXA2、FOXA3、和HNF1A。

17.权利要求2的方法，其中核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、SEQ IDNO:41的核酸序列、和含有SEQ ID NO:43的核酸序列。

18.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

19.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

20.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

21.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

22.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

23.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

24.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

25.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

26.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

27.权利要求2的方法，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

28.细胞群，其包含通过权利要求1或权利要求2的方法获得的诱导肝细胞。

29.分离的诱导肝细胞，其通过权利要求1或权利要求2的方法获得。

30.包含核酸制剂的组合物，其中当将所述组合物引入到非肝细胞的细胞中时，所述组合物能够将非肝细胞的细胞重编程为诱导肝细胞。

31.权利要求30的组合物，其中所述非肝细胞的细胞是人非肝细胞的细胞且所述诱导肝细胞是人诱导肝细胞。

32.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码选自由CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A所组成的组的一种或多种重编程因子。

33.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码选自由FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4所组成的组的一种或多种重编程因子。

34.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码CEBPA、GATA6、HHEX、HNF1B、HNF6A、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF1A、和HNF4A。

35.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、HNF4A、和GATA4。

36.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

37.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

38.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、FOXA2、HNF1A、和HNF4A。

39.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA2、FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

40.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、HNF1A、和HNF4A。

41.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA3、HNF1A、和HNF4A。

42.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA2、HNF1A、和HNF4A。

43.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、FOXA3、和HNF1A。

44.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA1、FOXA2、和HNF1A。

45.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子编码FOXA2、FOXA3、和HNF1A。

46.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、SEQ ID NO:41的核酸序列、和含有SEQ ID NO:43的核酸序列。

47.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

48.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

49.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

50.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

51.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

52.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:37的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

53.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:39的核酸序列、和SEQ ID NO:41的核酸序列。

54.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

55.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:33的核酸序列、含有SEQ ID NO:35的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

56.权利要求30的组合物，其中所述核酸制剂包含核酸分子，所述核酸分子包含含有SEQ ID NO:35的核酸序列、含有SEQ ID NO:37的核酸序列、和含有SEQ ID NO:39的核酸序列。

57.筛选测试化合物的方法，所述方法包括将通过权利要求1或权利要求2的方法获得的诱导肝细胞与测试化合物接触，和确定所述测试化合物对诱导肝细胞的作用。