CN104072579A

CN104072579A - 具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物

Info

Publication number: CN104072579A
Application number: CN201410259060.5A
Authority: CN
Inventors: 何坚; 刘叔文; 林冬果; 方堉欣; 王静瑜
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-06-11
Also published as: CN104072579B

Abstract

本发明公开了具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，小分子肽的氨基酸序列3～7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为X_0-3(R/K/O/D_ab)X_0-1W_1-2(R/K/O/D_ab)_0-1X_0-1；其中X为氨基酸R，K，W，I中一种；X_0-3为R，K，W，I中任意0～3个；X_0-1为R，K，W，I中任意0～1个；W_1-2表示1或2个W；(R/K/O/D_ab)_0-1表示0或1个氨基酸R或K或O或D_ab，D_ab为2,4-二氨基丁氨酸。实验证明本发明的小分子肽或其活性修饰物具有很好的抗菌抗病毒作用，在制备消除细菌、真菌或病毒药剂、消毒剂、清洁剂、防腐剂或包装材料中具有重要应用价值。

Description

具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物

技术领域

本发明涉及新型抗菌肽及其衍生物，具体涉及具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物。

背景技术

传统抗生素细菌耐药性已成为一个全球问题，迫切需要开发出新的抗菌药物。为了解决这个问题，抗菌肽(AntimicrobiaL peptides AMPs)已成为有潜力的可治疗耐药病原体引起的传染病。抗菌肽是生物体在外界病原微生物入侵时产生的具有抗菌活性的多肽物质，通常由12-45个氨基酸组成，分子量约40kD，是生物体非特异性免疫的重要组成部分。抗菌肽一级结构具有典型的特征，即N端富含Lys和Arg等极性氨基酸，而C端富含Ala、Val和Gly等非极性氨基酸，中间部分富含Pro，因此抗菌肽主要以阳离子形式存在。这类分子具有较强的保守性，同时具有分子量低、稳定性好、副作用小、水溶性强、强碱性、广谱抗菌、无耐药性等优点，广泛分布于哺乳动物、无脊椎动物、植物和微生物中，能产生天然的适应性免疫防御入侵的病原体。抗菌肽的序列和二级结构不同，但总是折叠成一个两性分子的构象与生物膜相互作用，同时带有正电荷，使其能与带负电荷的细菌膜相互作用。因此，AMPs对细菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤具有杀伤作用，尤其是多种抗生素耐药的微生物如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐药铜绿假单胞菌和不动杆菌等。

抗菌肽的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域，因此抗菌肽具有巨大的应用潜力。自从Boman等人在1972年首先在果蝇中发现了抗菌肽，随后1981年Steiner等人又从美国天蚕中成功地分离到两种抗菌肽Cecropin-A和Cecropin-B后，截止2014年初，已发现的天然AMPs超过2000条。近年来，计算机辅助药物分子设计技术的发展，极大的促进了抗菌肽的研究和开发，已有超过十个根据天然阳离子抗菌肽合成的类似物进入临床或临床前的试验阶段，典型的代表是蛙皮提取的Magainins是第一种进入药品开发程序的抗菌肽，美国马盖宁制药公司已经开发筛选出对细菌、病毒和肿瘤细胞均有明显的杀伤作用的两种新型抗菌肽：Pexiganan(MSI-78)和MAI1278现已进入临床III期试验，可以预测在不久的将来抗菌肽将会成为寻找新药的重要领域。TriPep公司正在研制的小肽GPG，已经在欧洲进行I/II期临床试验，治疗两周以上发现，病毒复制减慢，显示出一定的抗HIV应用前景；口服抗菌肽Ambicin和Isegangn已成功地完成I期安全性评价；加拿大MicroLogix生化技术公司的两种抗菌肽MBI-226和MBI-594进入II期或III期的严重粉刺感染的临床研究，其中MBI-226III期临床试验结果表明，在诱导期只有极小的刺激反应，与阴性组对照，蓄积刺激反应更小。最引人注目的Trimeris公司的抗HIV抗菌肽Enfuvritide(T20)已在数年前成功上市。

目前许多抗生素已产生抗药性，肽类抗菌物质具有独特的抗菌机制，对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，且不易产生耐药性，因此在不久的将来，这些肽类抗菌物质可能成为新型抗菌药物的来源，具有极好的市场开发与应用前景。

随着微生物学的发展，与传统抗生素相比，AMPs独特的作用机制使其具有高效和低耐药性的优势。尽管AMPs具有一定的优势，然而到目前为止较少AMPs药物达到临床实用的要求。因为AMPs存在生物利用度、毒性、稳定性和生产成本等问题。为了改善AMPs的属性，使其能开发成药物，合理的设计是解决问题的方法。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明合成了由3～7个氨基酸组成的超短抗菌肽及其活性修饰物，其不仅会大大地减少生产成本，进行结构优化后还显著降低可能引起的免疫原性反应。

本发明的目的在于提供抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物。

本发明所采取的技术方案是：

具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述小分子肽的氨基酸序列3～7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为X_0-3(R/K/O/D_ab)X_0-1W_1-2(R/K/O/D_ab)_0-1X_0-1；

其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种；

X_0-3表示氨基酸R，K，W，I中任意0～3个；

X_0-1表示氨基酸R，K，W，I中任意0～1个；

W_1-2表示1个或2个氨基酸W；

(R/K/O/D_ab)_0-1表示0个或1个氨基酸R或K或O或D_ab，其中D_ab为2，4-二氨基丁氨酸。

进一步的，上述小分子肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1～17所示的氨基酸序列。

进一步的，上述氨基酸为L-构型或D-构型的氨基酸。

进一步的，具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述活性修饰物的修饰部分为脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体、多聚体、缀合化修饰中至少一种。

进一步的，上述脂化修饰的基团选自脂肪酸，三萜类，甾体类，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团中的至少一种。

进一步的，上述脂肪酸为C2～C20脂肪酸。

进一步的，上述脂肪酸为C8～C20脂肪酸。

小分子肽及其活性修饰物在制备消除细菌、真菌或病毒药剂中的应用。

小分子肽及其活性修饰物在制备用于处理细菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒剂或清洁剂、防腐剂或包装材料中的应用。

编码上述小分子肽的核酸。

本发明的有益效果是：

1)本发明的AMPs对革兰氏阳性和阴性细菌具有广泛的和有效的抗菌活性。一些多肽除了具有破坏膜稳定性的潜在机制还表现出多个模式的细菌杀死方式。

2)本发明的AMPs除了其强大的杀菌活性，，一些抗菌肽与传统抗生素联合用药产生了不可预见的协同作用，这种联合使用的协同作用一方面可以有效降低抗生素的使用剂量，另一方面可以实现更好的抗菌效果。

3)在所有的抗菌肽，本发明合成的这些AMPs是最短的，因此具有易合成和成本低的优势，同时有潜力可发展为各种感染性疾病的治疗药物。如本发明中有有些AMPs还具有抗流感病毒、HIV的活性。

4)本发明提供了具有抗革兰阳性菌、革兰阴性菌、抗病毒作用的新型短脂肽。

附图说明

图1为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP3(C10-RKWWK)的HPLC图；

图2为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP3(C10-RKWWK)的MS图；

图3为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP14(C10-RIKWK)的HPLC图；

图4为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP14(C10-RIKWK)的MS图；

图5为C10脂肪酸和C14脂肪酸修饰的小分子肽的溶血活性；

图6为MTT试验评估C10-RKWWK和RKWWK细胞(TZM-b1)中的细胞毒性；

图7为流式细胞仪测定C10-AMP3(C10-RKWWK)对哺乳动物细胞的毒害速度；

图8为流式细胞仪测定C10-AMP14(C10-RIKWK)对哺乳动物细胞的毒害速度；

图9为C10-AMP3和C10-AMP14对S.aureus(C)的杀菌速度；

图10为C10-AMP4、C10-AMP3、C10-AMP7、RKWWK与Neomycin的联合用药的协同效应。

具体实施方式

其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种；

X_0-3表示氨基酸R，K，W，I中任意0～3个；

X_0-1表示氨基酸R，K，W，I中任意0～1个；

W_1-2表示1个或2个氨基酸W；

(R/K/O/D_ab)_0-1表示0个或1个氨基酸R或K或O或D_ab，其中D_ab为2，4-二氨基丁氨酸；因为精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(D_ab)和赖氨酸(K)在生理条件下表现出具有极性和带正电荷的性质，精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(D_ab)可以替换赖氨酸(K)。

优选的，上述小分子肽及其活性修饰物所带电荷至少为+2，序列控制在7个氨基酸以内，可以通过增加R，K，W，I等氨基酸来改变短肽的电荷、芳香性和疏水性，而调节赖氨酸(精氨酸)之间的距离也可以增强短肽的活性。

优选的，上述小分子肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1～17所示的氨基酸序列。

优选的，上述氨基酸为L-构型或D-构型的氨基酸。

优选的，具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述活性修饰物的修饰部分为脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体、多聚体、缀合化修饰中至少一种。

优选的，上述脂化修饰的基团选自脂肪酸，三萜类，甾体类，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团中的至少一种。

优选的，上述脂肪酸为C2～C20脂肪酸。

优选的，上述脂肪酸为C8～C20脂肪酸。

优选的，上述C8-C20脂肪酸选自月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和花生酸。

上述脂肪酸分子可以附着在本发明抗菌肽任何适当的部分，如氨基端、羧基端、或氨基和羧基两端等。

本发明小分子肽及其活性修饰物的抗菌抗病毒活性的机制

在本发明中，合成的有效的AMPs结合了短脂肽和RW丰富的肽的优势。对这一系列抗菌肽的活性测试表明，其对病原微生物包括革兰氏阴性杆菌大肠杆菌，革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌、白色念球菌、病毒等微生物具有抑制作用。溶血性实验表明其具有低毒性，而且部分AM/Ps具有抗病毒的作用。

含有R和W的多肽是现在主要的新型AMPs。然而，除了含有阳离子基团和疏水基团，含精氨酸和色氨酸的抗菌肽的重要性已经得到了充分的认识。有解释说，是因为形成了在带负电荷的电子云吲哚残基和各种阳离子氨基酸残基之间的阳离子π键，而精氨酸和赖氨酸就会导致细胞膜的破裂。基于以上发现，本发明合成了一系列含有R，K，W和I的超短脂肽。前期工作发现这些抗菌肽的活性可以通过疏水性，电荷和两性的改变进行调控。因此，增加电荷，改变极性/非极性氨基酸的位置，改变空间结构柔韧性，替换疏水/亲水残基等方法可以获得高活性的抗菌肽。为获得更多的疏水基团在抗菌肽中起的作用，进行了两个实验：(a)不同序列肽的疏水性通过反向高效液相分析；(b)同样序列的肽的疏水性可评估连接肽基头尾的各种脂肪酸(分别为C10和C18脂肪酸)。在这些实验的基础上，得出一个结论，一个活性强的抗菌肽是一个平衡的系统，存在一个最优疏水性高抗菌范围，也就是说，高疏水性并不总是直接与高效抗菌抗病毒能力成正比关系。减少或增加疏水性超出这个范围将大大影响其抗菌活性.因此，大多数肽以C18脂肪酸取代后没有C14、C10类似物的活性高。产生这种现象的原因是高疏水性的肽使其与细胞膜难以结合。

本发明抗菌肽具有共同的生物物理特性，如正电荷、疏水性和两性。这些理化性质都会影响对细胞膜的破坏和透化作用。本发明中，发现C10-RIKWK和C10-RKWWK具有相似的活性，但是其杀菌的机制则不相同。。这是C10-RKWWK能对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有选择性的原因。然而，现在还不能清楚的知道肽进入细菌的具体机制，可能是溶解膜或者破坏膜的完整性，从而与细菌内的靶点相作用。而DNA-binding实验说明肽与DNA的相互作用可能涉及到干扰DNA的复制、重组、修复、翻译等。C10-KIKRWR有较好的抗HIV-1病毒活性，并且对细胞的毒性较小，有继续进行试验的潜力。C18-KKWK、C18-KWK、C20-KKWK、C20-KWK则有抗H5N1的活性，在低浓度时有促进病毒感染的作用。

由于在pH值、离子强度和亲脂性的不同，本发明合成的短肽与不同细胞膜有不同的作用，也有不同的选择性。色氨酸和赖氨酸独特的物理化学性质使它们适合作为抗菌肽的组成模块。本发明的多肽是用精氨酸(R)、赖氨酸(K)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)组成的抗微生物的抗菌肽，其中一个具有某种物理和/或化学特性的氨基酸被换为另一个具有相同化学或物理特性的氨基酸，例如，精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(D_ab)和赖氨酸(K)在生理条件下表现出具有极性和带正电荷的性质，精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(D_ab)可以替换赖氨酸(K)。

总而言之，本发明含有精氨酸、赖氨酸、色氨酸的脂肽具有广谱、高效的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性。而除了有破坏生物膜的作用外，一些肽有多种的杀菌模式。本发明中，一些肽与传统的抗生素联用可以减少杀菌的剂量。而新合成的短脂肽是一类最短的抗菌肽。由于其具有易合成、低成本的优势，而可以开发成治疗抗感染的药物。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：

一、小分子多肽及其活性修饰物

(1)小分子多肽及其活性修饰物

本发明具有抗菌抗病毒小分子肽是以KWWK、KWK为基本基序、由3-7个氨基酸所组成的多肽。根据基本氨基酸序列KWWK、KWK得到的一系列抗微生物小分子肽的氨基酸序列通式为X_0-3(R/K/O/D_ab)X_0-1W_1-2(R/K/O/D_ab)_0-1X_0-1；其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种；X_0-3表示氨基酸R，K，W，I中任意0～3个；X_0-1表示氨基酸R，K，W，I中任意0～1个；W_1-2表示1个或2个氨基酸W；(R/K/O/D_ab)_0-1表示0个或1个氨基酸R或K或O或D_ab，其中D_ab为2，4-二氨基丁氨酸。其中抗菌抗病毒效果较佳的17条序列如表1所示。

表1 抗微生物小分子肽的氨基酸序列表

小分子多肽的活性修饰物是指对上述小分子多肽进行脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体化、多聚体化或缀合化修饰等等。

(2)小分子多肽及其活性修饰物的合成

小分子肽都是通过酰胺MHBA树脂使用标准9-芴甲基羰基Fmoc固相合成方法合成。序列的合成是在ABI433A多肽合成仪中进行。肽伸长反应条件为：以标准HBTU/HOBt为耦合试剂，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，2倍过量的二异丙基乙胺(DIEA)，8倍过量的含Fmoc保护基团的氨基酸或10倍过量的游离脂肪酸。肽都是使用试剂M从树脂裂解，试剂M包括87.5％三氟乙酸，2.5％乙二硫醇，5％茴香硫醚和5％去离子水(3h，室温)，粗产品沉淀在甲基叔丁基醚，相同的溶剂洗两次。

肽荧光标记进行氨基酸相同的耦合过程采用罗丹明作为酸溶剂，反应12个小时。每个肽的分子量通过电喷雾电离质谱(ESI-MS，Waters)证实。

肽纯化使用RP-HPLC，实验条件：流速1mL/min；流动相溶液A水(0.1％三氟乙酸)溶液B乙腈(0.1％三氟乙酸)；梯度15～20％B(2min)，20～60％B(6min)，60～80％B(4min)，80～90％B(4min)。所有的脂肽的纯度为85-90％。

二、小分子多肽及其活性修饰物的性质

表2为N端与C14脂肪酸共轭、C端酰胺化的小分子肽活性修饰物的如电荷(Ch)、疏水性(％Hp)、平均疏水性(MH)、等电点(PI)、在RP-HPLC色谱柱上的保留时间(RT)、相对分子量(MW)等理化性质。

表2 抗微生物多肽的命名、序列和理化性质

a：肽的N端与C14脂肪酸共轭，C端酰胺化；b：电荷(Ch)、等电点(PI)、疏水性(％Hp)基于酰胺化肽计算而不使用脂质部分的在线计算工具https://www.genscript.com/ssLbin/site2/peptide caLcuLation.cgi；c：MH(平均疏水性)的计算基于Kyte&DooLittLe模型使用网站http://www.bbcm.univ.trieste.it/rossi/HydroCaLcHydroMCaLc.htmL；d：RT(保留时间)单位为min。

从表2中可以看出，在保留时间为10～13min内，疏水性与保留时间密切相关，如C14-AMP5(C14-RWWR)的保留时间为12.5min，而C14-AMP9(C14-RWR)的保留时间为11.93min，可见C14-AMP9(C14-RWR)的保留时间比多一个色氨酸残基(疏水性高)的C14-AMP5(C14-RWWR)长。

图1～4为N端与C10脂肪酸共轭、C端酰胺化的小分子肽活性修饰物的HPLC图和质谱(MS)图，

二、小分子多肽及其活性修饰物的抗菌实验

最小抑菌浓度(MIC)测试

主要按照NCCLS(美国临床实验室标准化委员会)指南进行测试。分别将革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC12600)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coLi，ATCC25922)和白色念珠菌(C.albicans，ATCC 14053)培养得1x10⁸CFU/mL的菌液，再稀释到1x10⁵CFU/mL。将各小分子肽及其活性修饰物分别加入E.coli、S.aureu s和C.albicans菌液中，使E.coli和S.aureu s菌液中肽或其衍生物的浓度从31.2μg/mL逐渐稀释到0.97μg/mL，分别加入到E.coli和S.aureus菌液中；使白色念珠菌(C.albicans)菌液中肽或其衍生物浓度从62.5μg/mL逐渐稀释到1.98μg/mL。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在50％MH培养基37℃中培养17到20个小时，真菌在50％YPD培养基30℃中培养20个小时。另外，设置阳性对照实验，分别采用新霉素和C16-KGGK(现有的抗菌肽)处理细菌E.coLi和S.aureus。所有实验平行四到六个独立重复实验。检测结果如表3、4、5所示。

表3为N端与C14脂肪酸共轭、C端酰胺化的小分子肽活性修饰物的MIC检测结果；表4为含C10、C18脂肪酸的小分子肽活性修饰物的MIC结果；表5为小分肽AMP-3(RKWWK)及其活性修饰物的MIC结果；从表3～表5中可以看出，大多数的小分子肽及其活性修饰物可以有效地杀死大肠杆菌与金黄色葡萄球菌，各小分子肽及其活性修饰物是对金黄色葡萄球菌的抗菌活性之间几乎没有显著差异，这说明本发明的小分子肽及其活性修饰物的抗菌活性主要与其理化性质有关，特别是电荷和疏水性。

那么改变电荷或疏水性的会影响小分子肽的抗菌活性，如C14-AMP1(C14-KWWK)中插入一个异亮氨酸得到的C14-AMP2(C14-KIWWK)对大肠杆菌最小抑菌浓度(MIC)的增加了3倍多(表3)；另外，C10-KWWK(C10-AMP1)、C10-RWWR(C10-AMP5)和C14-KWWK(C14-AMP1)均具有强大的抗菌活性(表3和表4)，它们的抗菌活性是否会随它们的氨基酸序列的顺序而改变呢？本发明检测了肽序列为RWRW、KWKW、KKWW的小分子肽活性修饰物的抗菌活性，如表3～表5所示，所有这肽的活性修饰物，特别是C10修饰的肽活性修饰物表现出广泛而有效的抗菌，其MIC值低至3.9μg/mL。说明其抗菌活性主要受其电荷和疏水性的影响，在相同的电荷和疏水性的情况好，不同顺序的氨基酸序列对小分子肽及其活性修饰物的抗菌活性的影响不明显。

表3 为含C14脂肪酸的小分子肽活性修饰物的MIC结果

从表3和表4中可以看出，脂链的长度对小分子肽及其活性修饰物的抗菌活性存在一定的影响，N端分别与线性C10、C14和C18脂肪酸结合的小分子肽的抗菌活性中，大部分C14脂肪酸修饰的小分子肽的抗菌活性比C10脂肪酸修饰的要弱，而比C18脂肪酸修饰的要强。

表4 为含C10、C18脂肪酸的小分子肽活性修饰物的MIC结果

表5 小分肽AMP3(RKWWK)及其活性修饰物的MIC结果

^aRKWWK不含有脂肪链，^bN端用罗丹明标记。

三、抗病毒活性检测实验

(1)抗HIV-1_JRFL假病毒感染活性的检测

生长良好的U87.CD4.CCR5细胞消化后，离心收集，然后用1mL培养基吹打均匀，取少量细胞计数，剩余的分别用培养基稀释到1×10⁵个/mL，然后将细胞悬液按照100μL/孔接种96孔板，37℃，5％CO₂条件下培养过夜，每孔加入梯度稀释的小分子肽或其活性修饰物(50μL)与假病毒HIV-1_JRFL(50μL)，继续培养48h后，每孔加入100μL0.5mg/mL MTT溶液，37℃条件下孵育4h，于倒置显微镜下观察有没有结晶析出，或是否有其它杂质生成，做好标记。离心96孔板，轻轻吸去上清(既要吸走培养基又不能吸走底层的蓝色结晶)，150μL/孔加入DMSO溶解结晶。轻轻振荡10min，酶标仪读取A₅₇₀值。小分子肽或其活性修饰物测定浓度为：200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL。

检测结果如表6所示，其中，IC50是指抗菌肽抑制病毒复制的能力，是能够抑制50％病毒复制时的肽浓度。CC50就是指抗菌肽对细胞的毒性，是使50％细胞死亡时的肽浓度。从中可以看出C10-KIKRWR、KIWWK、KIKRWR、C10-KIWWK均具有抗HIV病毒的作用，尤其是C10-KIKRWR，其IC50浓度为37.241±1.421μg/mL，对HIV病毒具有很好的抑制作用，且对细胞的毒害作用弱，CC50浓度在200μg/mL以上。

表6 C10-KIKRWR、KIWWK、KIKRWR、C10-KIWWK的抗HIV结果

(2)抗H5N1假病毒感染活性的检测

将96孔细胞培养板的每孔接入100μL浓度为1x10⁵个/mL的MDCK细胞，5％CO₂，37℃培养过夜；用培养基将假病毒倍比稀释成6个稀释度，取50μL加入96孔细胞培养板中，再加入本发明的小分子肽或其活性修饰物(50μL)，每个稀释度(200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL)重复3个孔，终体积为200μL。设置细胞对照，不加假病毒。在5％CO₂，37℃条件下培养48h后，弃去培养基，200mL/孔，PBS洗涤1次。按照荧光素酶检测试剂盒说明书，检测假病毒的感染能力，具体检测操作如下：

A.每孔加入50μL裂解液，轻轻摇晃，在室温下静置20min，取409L细胞裂解液加入到96孔平底荧光素酶检测板中；

B.每孔加入60μL荧光素酶底物，用Genios Pro型Tecan酶标仪检测荧光素酶化学发光值。以细胞对照孔化学发光值的2.5倍作为cutoff值，化学发光值大于cutoff均视为阳性。

检测结果如表7所示，从中可以看出KKWK-C18、KKWK-C18、KKWK-C20、KKWK-C20具有较好的抗禽流感病毒的活性，尤其是KKWK-C18，其IC50浓度仅为8.874μg/mL。

表7 C18-KKWK、C18-KWK、C20-KKWK、C20-KWK的抗H5N1活性

四、细胞毒性研究

(1)溶血活性

在开发抗菌肽作为临床上有用的药物面临很重要的问题是对宿主细胞的毒性，抗菌肽必须能够区分哺乳动物和细菌细胞。在目前的研究中，肽的毒性评估通常利用人类红细胞检查其溶血活性。

本溶血活性实验选择最有效的肽用新鲜人类红细胞(红血球)，根据现有信息报道的方法进行测定。新鲜人类红细胞(红血球)用PBS洗3次，10％重旋在PBS中。平均体积(100μL)红细胞溶液加到96孔板中，板内包含同等体积的本发明的小分子肽或其活性修饰物的PBS溶液，浓度分别为62.5，125，250μg/mL，37℃孵化1h，3000rpm离心15min。然后在570nm处测量上层清液的吸光度(50μL96孔板)。用PBS和10％Triton X-100作为溶血实验的阴性和阳性对照。溶血百分比(Hemolysis rate)计算如下：

溶血百分比％＝[(Ab_peptide-Ab_PBS)/(Ab_Triton-Ab_PBS)]x100％

图5为C10脂肪酸和C14脂肪酸修饰的小分子肽的溶血百分比，从中可以看出大部分C10脂肪酸修饰的小分子肽和大部含色氨酸(W)数量少的小分子肽的溶血性低。溶血效应可能与色氨酸的数量和位置、及脂肪链的长度相关。色氨酸残基越多，越高的溶血性，如，C14-AMP12(C14-KWK)和C14-AMP1(C14-KWWK)，其中，在125μg/mL浓度的条件下，C14-AMP12(C14-KWK)容血效应为11％，而含2个色氨酸残基的C14-AMP1(C14-KWWK)的溶血效应达56％；然而，在相同的浓度下含2个色氨酸残基的C14-AMP-16(C14-KWKW)溶血毒性却为17％，这说明色氨酸位置也会影响抗菌肽及其衍生物的溶血活性；此外，在浓度为250μg/mL时，均含有一个色氨酸残基的C10-AMP12(C10-KWK)、C14-AMP12(C14-KWK)、C10-AMP14(C10-RIKWK)和C14-AMP14(C14-RIKWK)的溶血活性分别为＜10％、19％、＜10％、20％，这说明抗菌肽及其衍生物的血溶性与脂肪链的长度也有关。另外，从C10-AMP3(C10-RKWWK)、C10-AMP1(C10-KWWK)和C10-AMP4(C10-RIKWWK)的溶血性数据中可以看出，增加多肽的带电荷能有利于区别中性哺乳动物细胞膜和带负电荷的细菌细胞膜。总的来说，肽对人体红细胞的溶血毒性可调通过改变他们的物理化学参数特别是氨基酸残基的位置、带电性和疏水性。

(2)MTT测定细胞毒性

将96孔细胞培养板的每孔接入100μL浓度为1x10⁵个/mL的TZM-b1细胞，5％CO₂，37℃培养过夜，加入AMPs与哺乳动物细胞(TZM-b1)共同孵化48h。AMPs浓度如图5所示，500，250，125，62.5，31.2，15.6μg/mL。离心弃去上清液，按说明书加入MTT，再在37℃中孵育4h。最后，弃去MTT溶液，加入DMSO溶解甲瓒晶体，在570nm测其吸收度。细胞存活率的百分比计算公式为：AT/AC×100(AT：反应组的吸光度AC：对照组的吸光度)。每个数据表示为三个独立重复。

为了进一步评估本发明的抗菌肽潜在的细胞毒性和评估他们对原核和哺乳动物细胞的选择性，本实验测试了C10-AMP3(C10-RKWWK)和RKWWK对人类TZM-b1细胞的细胞毒性。显然，在125μg/mL浓度下C10-AMP3会引起细胞死亡，因为其CC50为115μg/mL(表4)，而RKWWK即使在浓度高达500μg/mL也没有发生细胞毒性(图6)。

(3)流式细胞术分析细胞毒性：

上述MTT细胞毒性试验检测了抗菌肽与哺乳细胞孵化超过48小时后，抗菌肽对哺乳动物细胞的毒害作用，本实验进一步研究在短时间(1h和2h)内抗菌肽对哺乳动物细胞及细菌的毒害作用。

TZM-b1细胞在含10％牛血清的高糖DMEM培养基中过夜培养，弃去上清液，再用PBS洗2遍，加入trypsin-EDTA(分别为0.05％和0.02％w/v)进行消化。接着加入含10％牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，800rpm离心5min。最后加入含10％牛血清的高糖DMEM培养基稀释细胞到2×10⁵ceLLs/mL。将C10-AMP3(C10-RKWWK)和C10-AMP14(C10-RIKWK)分别加入细胞中处理1h和2h，使C10-AMP3和C10-AMP14的浓度均为40μg/mL。实验最后细胞中加入碘化丙啶(10μg/mL)，4℃避光放置10min，用FACSCaLibur流式仪测定TZM-b1细胞的生存能力。

测定结果如图7和图8所示，从图中可以看出结果超过99％的TZM-b1细胞未在两小时内死亡，说明在短时间内本发明的小分子肽及其活性修饰物对哺乳动物细胞的毒害作用非常弱。

杀菌速度的测定：在浓度为1×10⁵CFU/mL的S.aureus菌液中加入AMPs(C10-AMP3和C10-AMP14)，使AMPs浓度为40μg/mL(10倍MIC过量)，在25℃下分别共孵育0，60，120min，在冰浴中分别取10μL的细菌悬浮液，用培养基按1∶50稀释，37℃有氧培养过夜后测定滴度。测定结果如图9所示。

从图7～9中可以看出，相同浓度的C10-AMP3和C10-AMP14分别作用于哺乳动物细胞和细菌(S.aureus)1h、2h后，TZM-b1细胞的生存能力用流式细胞术检测，结果超过99％的TZM-b1细胞未在两小时内死亡(图7和图8)，而在1h后超过95％的金黄色葡萄球菌全被杀死(图9)。说明在短时间内本发明的小分子肽及其活性修饰物对哺乳动物细胞的毒害作用非常弱，而对细菌具有很好的毒害作用。

五、协同效应分析

三个有效的肽C10-AMP4(C10-RIKWWK)、C10-AMP7(C10-KIKRWWR)、C10-AMP3(C10-RKWWK)和RKWWK(不含脂链)分别与新霉素(Neomycin)联合作用。在96孔板中加入5μL的抗菌肽溶液，从左到右稀释成不同的浓度(3.12到0.097μg/mL)，再加入10μL的新霉素溶液，最后加入100μL的细菌悬浮液，在37℃下共孵育17h后，检测各组的抗菌效果。每个数据重复了两次。

图10为二维筛选抗菌肽协同效应，从左到右是肽的浓度梯度(μg/mL)，而从上到下是新霉素的浓度梯度(μg/mL)。图10中顶部分为C10-AMP4(C10-RIKWWK)和新霉素，C10-AMP3(C10-RKWWK)和新霉素的共同作用，底部为C10-AMP7(C10-KIKRWWR)和新霉素，RKWWK和新霉素的共同作用。图中斜体格表示二者实现了协同效应。

从图10中可以看出本发明中的小分子肽或其活性修饰物还可以同相关的抗生素联合使用并产生不可预见的协同作用，即这两种抗菌药物联合使用时所得到的抗菌效果比这两药单独使用的效果和更好，这种联合使用的协同作用一方面可以降低抗生素的使用剂量，另一方面可以实现更好的抗菌效果。

<110> 南方医科大学

<120> 具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工合成肽

<400> 1

Lys Trp Trp Lys

1

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成肽

<400> 2

Lys Ile Trp Trp Lys

1 5

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<212> PRT

<213> 人工合成肽

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1 5

<210> 4

<211> 6

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<213> 人工合成肽

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1

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<213> 人工合成肽

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<212> PRT

<213> 人工合成肽

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<212> PRT

<213> 人工合成肽

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1

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<212> PRT

<213> 人工合成肽

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1 5

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成肽

<400> 11

Lys Lys Ile Arg Trp Arg

1 5

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工合成肽

<400> 12

Lys Trp Lys

1

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工合成肽

<400> 13

Lys Lys Trp Lys

1

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成肽

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Arg Ile Lys Trp Lys

1 5

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人工合成肽

<400> 17

Lys Lys Trp Trp

1

Claims

1.具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于：所述小分子肽的氨基酸序列3～7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为X_0-3(R/K/O/D_ab)X_0-1W_1-2(R/K/O/D_ab)_0-1X_0-1；

其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种；

X_0-3表示氨基酸R，K，W，I中任意0～3个；

X_0-1表示氨基酸R，K，W，I中任意0～1个；

W_1-2表示1个或2个氨基酸W；

(R/K/O/D_ab)_0-1表示0个或1个氨基酸R或K或O或D_ab，其中D_ab为 2,4-二氨基丁氨酸。

2.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于：所述小分子肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1～17所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于：所述的氨基酸为L-构型或D-构型的氨基酸。

4.根据权利要求1或2所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于：所述活性修饰物的修饰部分为脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体、多聚体、缀合化修饰中至少一种。

5.根据权利要求4所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于：所述脂化修饰的基团选自脂肪酸，三萜类，甾体类，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽衍生物，其特征在于：所述的脂肪酸为C2～C20脂肪酸。

7.权利要求1-6中任一所述的小分子肽及其活性修饰物在制备消除细菌、真菌或病毒药剂中的应用。

8.权利要求1-6中任一项所述的小分子肽及其活性修饰物在制备用于处理细菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒剂或清洁剂、防腐剂或包装材料中的应用。

9.编码权利要求1 中所述小分子肽的核酸。